I denne protokollen beskriver vi hvordan å utnytte [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose fantes et positron utslipp tomografi og beregnede tomografi (18F-FDG PET/CT) imaging for å måle svulst metabolsk respons på målrettet terapi MLN0128 ved en Kras/Lkb1 mutant mus modell av lungekreft og kombinert bildebehandling med høy oppløsning ex vivo autoradiography og kvantitative histology.
Et kjennetegn på Avansert tumorer er bytte til aerobic Glykolysen som måles lett av [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose fantes et positron utslipp tomografi (18F-FDG PET) tenkelig. Co mutasjoner i KRAS proto-oncogene og LKB1 tumor suppressor genet er hyppig hendelser i lungekreft som driver hypermetabolic, glycolytic tumor vekst. En kritisk sti regulerer vekst og metabolisme av disse svulstene er mekanistisk målet på rapamycin (mTOR) veien, som kan målrettes effektivt bruker selektiv katalytisk mTOR kinase inhibitors. Den mTOR inhibitor MLN0128 undertrykker Glykolysen i mus med svulster Kras og Lkb1 co mutasjoner, kalles KL mus. Terapi responsen i KL mus måles første 18F-FDG PET og tomografi (CT) imaging før og etter levering av MLN0128. Ved å benytte 18F-FDG PET/CT, kan forskere måle dynamiske endringer i glukose metabolisme genmodifiserte musen modeller (GEMMs) av lungekreft etter en terapeutisk intervensjon med målrettet terapi. Dette etterfølges av ex vivo autoradiography og en kvantitativ immunohistochemical (qIHC) analyse med morphometric programvare. Bruk av qIHC kan oppdage og kvantifisering av forskjellige endringer i biomarkør profiler etter behandling samt karakterisering av klar svulst patologi. Koplingen av PET imaging å kvantitative histology er en effektiv strategi å identifisere metabolske og terapeutiske svar i vivo i musen modeller av sykdom.
Vår forskning har fokusert på å undersøke og målretting kreft mutasjoner i leveren kinase B1 (LKB1, også kalt STK11) mutant kreft1. LKB1 er en master tumor suppressor som represses mTOR komplekse 1 (mTORC1) gjennom aktivering av AMP kinase (AMPK) fører til regulering av vekst og metabolisme. Derfor fører tap av LKB1 til en uhemmet mTORC1 aktivisering, aktivering av HIF1-alfa resulterende i en glycolytic metabolske fenotypen ofte referert til som Warburg effekt2,3,4. LKB1 inaktivere mutasjoner fører direkte til utvikling av en sjelden familiær kreft pre fjerning syndrom kjent som Peutz-Jeghers syndrom (PJS) som er preget av utviklingen av godartet gastrointestinal polypper kalles hamartomas5 , 6 , 7. videre LKB1 ofte co mutates med kreftfremkallende KRAS hypermetabolic og aggressiv menneske lunge svulst8,9.
Lkb1-relaterte sykdommer er lett modellert i mus. Den heterozygote inaktivering av Lkb1 i mus fører til utvikling av hamartomas nøyaktig modellering PJS10,11,12,13. I tillegg recapitulate Lkb1 mutasjoner som er lett presist i mus kreft fenotyper i lungene, hud, bukspyttkjertel, og bryst14. Co mutasjon av Kras/Lkb1 i lungevev av transgene mus, med en grobunn recombinase-mediert aktivering av kreftfremkallende KrasG12D allelet og biallelic sletting av Lkb1, resulterer i dannelsen av aggressiv og metastatisk lungekreft svulster15 ,16. Karakterisering av KrasG12D; Lkb1– / – (KL) lunge svulst isolert fra mus viser disse svulstene har en høy mTORC1 aktivisering og er svært glycolytic, bruke både direkte metabolitten målinger av glukose og laktat eller måle forbruket av [18F] -2- fluoro-2-deoxy-D-glukose (18F-FDG) av fantes et positron utslipp tomografi (PET) med beregnede tomografi (CT) 17. MTORC1 hyper-aktivering i LKB1 mutant svulster gir en klar begrunnelse for testing av både allosteric og katalytiske kinase hemmere av mTOR å behandle disse kreft.
I en tidligere studie viste vi at allosteric mTORC1 hemmer rapamycin (RAPA) ble hemmet vekst og Glykolysen i gastrointestinal (GI) svulster med en Lkb1+/- transgene musemodell av PJS3. RAPA er foreløpig godkjent som en enkelt agent terapi for behandling av Nyrecellekarsinom men viste begrenset effekt i NSCLC18,19,20. RAPA er en allosteric mTORC1 inhibitor og kan forbedres ved utvikling av neste generasjons mTOR katalytisk kinase hemmere som leverer en mer nesten komplett hemming av mTOR komplekser 1 og 2 (mTORC1 og mTORC2, henholdsvis)21. Stoffer som MLN0128 evalueres nå i preklinisk studier og tidlige fasen kliniske studier22,23. En fersk studie fra vårt laboratorium vist at MLN0128 er en potent mTOR hemmer menneskelige lunge svulst celle linjer og i vivo KL GEMMs lunge kreft15,16. MLN0128 undertrykt lunge svulst vekst og glukose stoffskiftet i disse mus24.
I denne studien tar vi nytte av godt karakterisert adenoviral grobunn-indusert musen modeller av lungekreft initiert av en betinget aktivert Lox-stopp-Lox-KRASG12D oncogene15,25. Disse KrasG12D mus var korslagt med mus har floxed alleler av Lkb1 (Lkb1L/L) til å generere KrasG12D; Lkb1L/L (KL) mus16. Etter intranasal levering av adeno- eller lentivirus uttrykke grobunn recombinase, utvikle KL musene tidlig lesjoner av 4 uker etter svulst induksjon. 6 uker, tumorer i KL mus endre fra adenomatøse svulster en mer ondartet, aggressiv svulst fenotypen typisk for lunge kreftsvulster, og 8-10 uker utvikle musene frank kreftsvulster med en 100% penetrance16,26.
Begge PET/CT tenkelig og kvantitativ immunohistochemistry kan benyttes for å avgjøre de molekylære og metabolske svarene samt de terapeutiske tiltak i tumorer etter levering av målrettet behandling som MLN012817, 26,27. Beskrevet her er en eksperimentell protokoll som benytter 18F-FDG PET imaging for å måle metabolsk respons på en MLN0128-målrettet terapi. Kopling PET bildebehandling med kvantitative histology kan måling av molekylære svaret mTOR hemming og kvantifisering av svulst byrden og svulst histology.
Denne artikkelen beskrives et imaging eksperimentelle tilnærming som utnyttet 18F-FDG PET/CT bildebehandling med qIHC for å måle både på metabolske og molekylære svarene i lunge svulst etter levering av mTOR hemmer MLN0128. MLN0128 redusert effektivt de 18F-FDG forbruk, som indikerer en betydelig metabolic respons i tumorer. Ved å koble PET/CT imaging til immunohistochemistry, kunne vi romlig registrere inndelte svulster på 3D PET/CT-bildene og utføre en detaljert undersøkelse av hele svulster på mobilnettet og molekylære nivå. Dette gjorde det mulig å bekrefte at MLN0128 hemmet mTOR signalnettverk, som dermed bekrefter en på målet molekylær svar på stoffet i tumorer. Endelig, ved hjelp av kvantitative histology, kunne vi kart og separat klar svulst patologi, som samlet svulst masse fra tumor nekrose, definere adenocarcinoma fra squamous celle kreftsvulster og utfylle microPET bildebehandling.
MicroPET er for tiden begrenset av en romlig oppløsning på ca 1 mm. I tillegg kan 18F-FDG oppbevaring i visse vev påvirkes av flere faktorer, inkludert plasma glukose nivåer, type og varighet av bedøvende eksponering, miljømessige temperaturen og den generelle helsen til dyr, som kan påvirke 18 F-FDG farmakokinetikken30. Disse parameterne er optimalisert for denne protokollen, men skal være optimalisert for hver dyremodell. Reproduserbarhet studier av 18F-FDG bildebehandling av subkutan svulster i mus demonstrere en variasjonskoeffisienten for det betyr %ID/g om lag 15%, antyder at svulsten terapeutiske responsen på en enkelt mus vurdert av 18 F-FDG PET bør være større enn denne terskelen vurderes pålitelig og betydelig31.
Cellulære og selv subcellular distribusjon av PET tracers kan vurderes av vev autoradiography med delene senere farget og co registrert med qIHC. Co registrering PET med CT kan en PET bildet settes i anatomiske sammenheng; Dette er svært verdifull, selv med lav bløtvev kontrast. Mangel på bløtvev kontrast ved CT kan overvinnes med magnetisk resonans imaging (MRI). I tillegg biomarkers for fluorescens bildebehandling kan brukes til å vurdere Glykolysen i vivo, men Foton absorpsjon og scatter i lunge hulrom kan påvirke den nøyaktige kvantifisering eller deteksjon følsomhet32. I sammendraget gir utnytte hele dyr PET/CT-bildebehandling med kvantitative histology en nøyaktig og sanntids kart over svulst biologi etter terapeutisk intervensjon.
Multispectral imaging (MSI) er gjeldende i en situasjon hvor et fargebilde kan brukes. I det minste, MSI gir samme informasjon som et fargebilde, og for enkelte programmer, MSI kan gi mer detaljert informasjon om spektrale egenskapene til et utvalg enn en enkel bredbånd tre farger (RGB) bilde. Begrensningene for MSI er generelt de farge Imaging, bortsett fra at MSI er tregere og tar mer tid å hente bilder. Morphometric programvaren ble brukt til å få reproduserbare, nøyaktig segmentering resultater for bilder og er beskrevet i Tabellen for materiale. Det er flere kommersielt tilgjengelige produkter som kan brukes til vev segmentering og kvantifisering av histology.
Kompleksiteten i kreft metabolisme strekker seg utover Warburg effekt og glukose metabolisme33,34. Det er svært sannsynlig at svulster vil lett tilpasse seg enkelt agent behandlinger som hemmer Glykolysen. Avhengigheten av aminosyre metabolisme har vært godt dokumentert i kreft, og det forventes at svulster stole på en rekke amino acids som glutamin, glysin, og serine, samt andre metabolitter som frie fettsyrer35,36, 37. I tillegg til 18F-FDG har sonder som 18F – og 11C-merket glutamin, kolin, acetate, 1-(2-Deoxy-2-fluoroarabinofuranosyl) cytosine (FAC) og fluorothymidine (FLT) blitt brukt til bildet aminosyre, nukleotid og lipid stoffskiftet i dyr modeller av kreft38,39,40,41. Automation og Mikroskala tracer radiochemistry teknologi kombinert med høyere oppløsning, høyere følsomhet PET skannere vil forbedre tilgjengeligheten av PET for å måle ulike biologiske prosedyrer42,43. Forståelsen av stoffskiftet øker er det logisk at repertoaret av PET radiotracers vil øke også, slik at forskere og leger til noninvasively profil svulst metabolisme.
Utnyttelsen av PET/CT tenkelig og kvantitativ histology løser et klinisk behov, som er å raskt oversette benk funn i klinisk bruk. Dette må forskere kunne måle terapeutiske svaret samt ervervet motstanden mot narkotika, som PET/CT imaging gjør. Dessuten, PET/CT og immunohistochemical analyse av lunge svulst brukes som standarden på omsorg for pasienter, og dermed er direkte oversettbare i klinisk praksis. Viktigere, identifiserer PET/CT imaging lett terapi-resistente svulster, der forskere kan isolere og avhøre på molekylært nivå for å bedre forstå mekanismene av sykdom. Dette er en iterativ prosess som har gjort det mulig å forstå mekanismene motstand og utforme mer effektive strategier for klinisk oversettelsen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker University of California Los Angeles’ Crump Preclinical Imaging teknologi Center for deres hjelp med PET/CT avbilding av musene, translasjonsforskning patologi Core laboratorie- og statistikk kjernen ved University of California Los Angeles’ David Geffen School of Medicine for deres hjelp med svulst eksempel forberedelse og analyse. For finansiering, David B. Shackelford ble støttet av CTSI og KL2 translasjonsforskning Science Award gi nummer KL2TR000122 og UL1TR000124 på David Geffen medisinavdelingen ved UCLA og av den avdeling av forsvarer lunge kreft forskning Program translasjonsforskning Forskning samarbeid W81XWH-13-1-0459 og ACS RSG-16-234-01-TBG. Sean T. Bailey ble støttet av en NIH T32 trening stipend HL072752 gjennom David Geffen medisinavdelingen ved UCLA. Anthony Jones støttes av UCLA svulst celle biologi treningsprogrammet (USHHS Ruth L. Kirschstein institusjonelle National Research Service Award # T32 CA009056). Gihad Abdelhady støttes av en NIH/NCI mangfold Supplement R01CA208642.
G8 PET/CT | Perkin Elmer | CLS139564 | Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice |
Axio Imager.M2 | Zeiss | 490020-0003-000 | Acquiring images of FFPE lung tumor sections |
Inform software | Perkin Elmer | CLS135781 | Morphometric used for image analysis of tumor pathologies |
Glut1 antibody | Alpha Diagnostics | GT12-A | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb | Cell Signaling Technologies | 4858 | IHC staining of FFPE lung tumor sections |
MX35 Premier microtome blades | Thermo Fisher Scientific | 3051835 | Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography |