En protokoll for matrix-assistert laser desorpsjon ionization tiden for flygningen massespektrometri (MALDI-TOF MS) karakterisering av syntetiske polymerer er beskrevet inkludert optimalisering av prøven forberedelse, spectral oppkjøp og dataanalyse.
Det er mange teknikker som kan brukes i karakterisering av syntetiske homopolymer, men få gi nyttig informasjon for slutten analyse som matrix-assistert laser desorpsjon ionization tid med flight-massespektrometri (MALDI-TOF MS). Denne veiledningen viser metoder for optimalisering av prøven preparatet, spectral oppkjøpet, og dataanalyse av syntetiske polymerer med MALDI-TOF MS. kritisk parameterne under eksempel forberedelse, omfatter valg av matrisen, Identifikasjon av en passende cationization salt og tuning de relative proporsjonene i matrisen, cation, og analytt. Oppkjøp-parametere, for eksempel modus (lineær eller reflektor), polarisering (positiv eller negativ), akselerasjon spenning og tidsforsinkelsen, er også viktig. Gitt kjennskap til kjemi involvert å syntetisere polymer og optimalisere både oppkjøpet dataparametrene og prøve forberedelse forhold, skal spectra oppnås med høy nok oppløsning og masse nøyaktighet for å aktivere det entydig fastsettelse av slutten gruppene med de fleste homopolymer (massene under 10 000) i tillegg til gjenta enheten masse og generelle molekylvekt distribusjon. Selv om vist på et begrenset antall polymerer, er disse generelle teknikker gjelder for et mye bredere spekter av syntetiske polymerer for å bestemme masseforsendelser, om slutten gruppe besluttsomhet er bare mulig for homopolymer med smale dispersity.
Med forbedringer i levende polymerisasjon teknikker, presisjon polymerer med kvantitativt functionalized slutten grupper er stadig mer tilgjengelig1. Samtidige utviklingen av azide-alkyne og thiolene Klikk kjemikalier har aktivert nesten kvantitative koblingen av makromolekyler til andre moieties, gir tilgang til en rekke hybrid materialer2,3,4 . Men må nøyaktig analytiske teknikker karakterisere både Start materialer og produkter av disse polymer Bøyning reaksjoner. Matrix-assistert laser er desorpsjon/ionisering flight-massespektrometri (MALDI-TOF MS) en verdifull myk ionisering analytisk teknikk for å karakterisere polymerer fordi det kan generere polymer ioner i en enkelt opplading tilstand med minimal fragmentering5,6. MALDI-TOF MS har store fordeler over andre konvensjonelle metoder for polymer karakterisering fordi det kan gi masse spectra med oppløsning på den personlige n-mers i polymer masse distribusjon. Som en konsekvens, kan slik masse spectra gi nøyaktig informasjon om den gjennomsnittlige Molekylvekten, gjenta enhet masse, og molekylvekt dispersity7, som igjen kan belyse konkurrerende polymerisasjon mekanismer som kjeden overføring8 . MALDI-TOF MS er imidlertid spesielt kraftig på å gi informasjon om polymer slutten grupper9,10, som kan brukes til å bekrefte slutten gruppen endringer10,11 og andre transformasjoner12 som polymer cyclizations11,13. Like viktig, den relativt lille mengden analytt (sub-mikrogram) kreves for masse spectrometric analyse gjør denne teknikken nyttig karakterisering når bare spor mengder materiale er tilgjengelige.
MALDI-TOF MS analyse av polymerer kan deles inn i fire adskilte trinn: prøve forberedelse, instrument kalibrering, spectral oppkjøp og dataanalyse. Eksempel forberedelse er det viktigste steget for generering av optimalisert MALDI-TOF masse spectra og oppstår før prøven er innført i instrumentet14,15. Valg av en passende matrise med lignende løselighet parametere som polymer analytt er avgjørende for å få høy kvalitet MALDI-TOF masse spectra og retningslinjer for valg av matrix har vært rapportert andre steder14,15, 16,17. En database av polymer MALDI “oppskrifter” for eksempel forberedelse har også vært publisert online18. For romanen polymerer, kan matrix utvalg bli kontaktet ved første forstå Løseligheten av polymer og velge en matrise med lignende løselighet parametere14,19. Polymerer med høy proton affinitet kan protonerte av de fleste matriser14 (som ofte inneholder karboksylsyre grupper), men for andre polymerer, en cationization agent er nødvendig14. Alkaliske ioner adduct med oksygen inneholder arter (f.eks. polyesters og polyethers), mens umettede hydrokarboner (f.eks. polystyren) adduct med overgangen metaller som sølv og kobber ionene14, 19. fordi polymer prøvene i dette eksperimentet oksygen atomer i ryggraden, natrium- eller kalium trifluoroacetate (TFA) ble brukt som cationization agent. Når matrise og cationization agenter er valgt, må den relative andelen analytt kasjon agent og matrix optimaliseres nøye for å sikre høy signal til støy. I denne fremgangsmåten parameterne for eksempel forberedelse allerede er optimalisert, men en empirisk eksempel optimalisering prosedyre (trinn 1.4.1., figur 1) som systematisk varierer konsentrasjonen av de tre komponentene (analytt, matrise og kasjon) gjelder for raskt å bestemme sine optimal prosenter.
Datainnsamling krever også optimalisering av en rekke parametere. De viktigste parameterne inkluderer positive eller negative ion modus spektrometer, instrument betjeningsmodus (lineær versus reflektor), akselerasjon spenningen og utvinning tidsforsinkelsen. En annen måte at oppløsningen kan økes er gjennom bruk av “reflectron” modus20,21,22,23. Reflectron modus doblet flyleden ioner til detektoren reflekterer ioner på slutten av flyet tuben tilbake mot en detektor nær kilden mens refokusering ioner med forskjellige momentums, og dermed øke oppløsningen skjønt redusere signalstyrken. I tillegg kan høyere oppløsning spectra fås ved å redusere laser makt som reduserer signal-til-støy forholdet med redusere antall og energi av kollisjoner og derfor redusere fragmentering og kinetisk inhomogeneities24. Ved tuning alle disse parametrene, kan ionene være fokusert for å minimere virkningen av noen inhomogeneity i første posisjon eller hastighet som oppstår under laser desorpsjon prosessen. Når parameterne oppkjøpet er optimalisert, kan isotopanrikning oppløsning ofte oppnås for ioner med massene over 10.000 Da, om dette er også avhengig av lengden på fly røret og instrument design. De fleste organiske forbindelser som inneholder minst én hvilket er utsatt for complexing med alkaliske kasjoner som litium, natrium og kalium. Mange av alkalimetaller er monoisotopes eller begrenset isotoper og derfor ikke utvide distribusjonen.
Mens parameterne apparatet stilles for å optimalisere data presisjon, oppnås bare datanøyaktigheten med en riktig kalibrering11. Proteiner og peptider ble opprinnelig brukt som calibrants på grunn av deres monodispersity og tilgjengelighet, men lider av forskjellige og utbredelsen av urenheter25. Mer kostnadseffektiv og stabil alternativer har inkludert uorganiske klynger og polydisperse, polymerer,26,,27,,28,,29. Dessverre disse alternativene har spre masser, som kompliserer masse oppdrag, samt mindre massene samlet gjør dem nyttige for kalibreringer under 10.000 Da. Å bekjempe disse problemene, Grayson et al. 25 utviklet et dendrimer-basert, polyester MS kalibreringssystem som er monodisperse, og har både bred matrise og løsemiddel kompatibilitet, holdbarhet stabilitet (> 8 år) og lavere produksjonskostnad. Basert på styrken av dette systemet, ble det valgt som calibrant for disse eksperimentene.
Det er to hovedtyper av kalibrering: interne og eksterne30. Når kalibrering eksternt, plasseres en standard med massene som brakett for analytt på MALDI målet platen i en annen prøveposisjon enn analytt generere et eget masse spekter som en kalibrering-fil blir generert. Økt nøyaktighet kan derimot, ofte oppnås med en intern kalibrering, som medfører blander calibrant med analytt å skaffe et hybrid spektrum med både calibrant og analytt signaler. I fremgangsmåten nedenfor, iverksatt en ekstern kalibrering. Etter riktig kalibrering av masse skalaen, kan nøyaktig analytt masse data skaffes. For å sikre nøyaktig kalibrering, er det viktig at datainnsamling oppstår etter kalibreringen.
Til slutt, når den optimalisert, kalibrert datasett anskaffet, og dataene ble analysert gir strukturell informasjon om polymer prøvene. Avstanden mellom n-mers i polymer fordelingen kan gi nøyaktig måling av gjentatte masse. Antall gjennomsnittlig molekylvekt (Mn) og andre masse distribusjon beregninger (f.eksMw (vekt gjennomsnittlig molekylvekt) og Đ (dispersity)) kan også fastslås fra signal distribusjon i masse spectra ( Trinn 4.2 for beregninger). Kanskje mest unikt, kan ved homopolymer, summen av slutten gruppe massene bekreftes ved å bestemme forskyvningen av polymer distribusjon forhold til massen av gjentatte alene. Til informasjon MALDI-TOF masse spectra gir verdifull karakterisering data som er komplementære til mer tradisjonelle polymer karakterisering teknikker som størrelse utelukkelse Ture, Fourier-transform infrarød spektroskopi, og kjernefysiske magnetisk resonans.
MALDI-TOF massespektrometri er et uvurderlig analytiske verktøy for polymer karakterisering på grunn av sin evne til å generere polymer ioner i enkeltvis ladet staten og med minimal fragmentering. Denne myke ionisering teknikken utnytter kort laser pulser for å desorb SSD prøver av polymer analytt innebygd i en matrise sammensatte å generere polymer ioner i gassform. Macromolecules er vanligvis ionisert av complexation med kasjoner som legges til matrix å aktivere sine analyser av massespektrometri. Disse macromolecular ioner deretter fremskyndet av en utvinning spenning å bringe dem inn i feltet uten regionen flight røret kan aktivere deres m/z skal fastsettes basert på deres tid-av-fly mellom ion kilden og detektor5 , 32.
Sammenlignet med andre polymer karakterisering teknikker, er MALDI-TOF MS spectra kvaliteten sterkt avhengig av oppkjøpet dataparametrene og prøve forberedelse. Selv om det er ingen fastsatt formel for eksempel forberedelse, tillater forstå funksjonen til hver komponent i prøven utarbeidelse rask empirisk optimalisering. Den viktigste faktoren i MALDI eksempel forberedelse er utvalg av matrisen fordi kompatibilitet matrisen med polymer analytt er avgjørende for at glade matrix å generere enkelt, desorbed makromolekyler i en ionisert staten5, 15,17,19. Når riktig matrise og cationization agenter er valgt, må de riktige forholdet mellom analytt, matrise og cationization agent bestemmes. Dette kan oppnås empirisk ved å opprette en todimensjonal rutenett av prøver (figur 1) på MALDI-TOF MS målet platen (figur 2) med økende matrix konsentrasjon på en akse og øke cationization agent konsentrasjon på den andre.
Lik MALDI eksempel forberedelse, det er ingen fastsatt formel for fastsettelse oppkjøpet dataparametrene; imidlertid anses bestemte trender å fremskynde spectral optimalisering. Reflectron modus, som øker oppløsning, men reduserer totale signalet er vanligvis valgt for lavere masse områder (i disse eksemplene nedenfor 4000 Da) der isotopanrikning oppløsning kan oppnås. I slike tilfeller ble monoisotopic masse beregninger og topp plukke metoder brukt. For polymer prøver med massene over 4000 Da, ble lineær modus brukt med gjennomsnittlig masse beregninger og topp plukke metoder. For å forbedre signal oppløsning, ion kilde spenninger bør justeres i små intervaller med den generelle trenden med større masse polymerer har en større spenning differensial (IS1 mot IS2).
Stund optimalisert eksempel forberedelse og oppkjøp parametere kan gi presisjon, masse nøyaktighet kan bare oppnås gjennom effektiv kalibrering. Tid-av-klassen for en gitt vevsmasse kan variere subtilt med hensyn til variabel oppkjøpet parametere og selv plate stillinger, derfor en kalibrering skal utføres for hvert sett med optimalisert oppkjøpet parametere for å gi nøyaktig masse bestemmelser5,30. Når oppkjøpet parameterne og prøve forberedelse er optimalisert, bør til spectra kalibreres disse nøyaktig samme betingelser.
Enestående oppløsning og masse nøyaktighet i de optimaliserte MALDI-TOF masse spektra av polymerer, har denne teknikken blitt et verdifullt gratis verktøy for å bestemme polymer massedistribusjon data. Men dens evne til å løse enkelte gjenta enheter i polymer masse distribusjon gir en spesiell fordel for slutten analyse i forhold til andre polymer karakterisering teknikker som gel gjennomtrengning kromatografi (GPC) og kjernefysiske magnetisk resonans (NRM). Dette er spesielt nyttig for å bestemme gjengivelsen av slutten gruppe functionalization reaksjoner og kvantitative natur slutten gruppe conjugations reaksjoner. Dette manuskriptet har vist evnen til å løse masse personlige polymer gjenta enheter med opptil to desimaler poeng for masse nøyaktighet, slik bekreftelse av slutten gruppen endringer med en høy grad av tillit. Med betydelige fremskritt har gjort nylig innen presisjon polymer syntese, MALDI-TOF MS blir et stadig viktigere verktøy for bestemme macromolecular strukturen og funksjonaliteten.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter Smart materialer Design, analyse og behandling consortium (SMATDAP) finansiert av National Science Foundation under samarbeidsavtale IIA-1430280 og LA styret i Regents et graduate fellowship (MEP). Polymer prøver for disse eksperimentene ble levert av MilliporeSigma (Sigma Aldrich). Open Access publisering av denne artikkelen er sponset av MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |