माउस Monocyte के आइसोलेशन प्रोटोकॉल-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और उनके बाद में ट्यूमर प्रतिरक्षा परिसरों के साथ इन विट्रो सक्रियण
Summary
Monocyte-व्युत्पंन डीसी (MoDC) खतरे से जुड़े अणुओं की मामूली मात्रा में समझ सकते है और इसलिए आसानी से प्रधानमंत्री हैं । हम रक्त और ट्यूमर और प्रतिरक्षा परिसरों के साथ उनके सक्रियण से MoDC के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हुए प्रमुख सावधानियों है कि क्रम में उनके समयपूर्व सक्रियण से बचने के लिए विचार किया जाना चाहिए पर प्रकाश डाला ।
Abstract
वृक्ष कोशिकाओं (डीसी) विषम कोशिका आबादी है कि उनके सेल झिल्ली मार्करों में अलग हैं, प्रवास के पैटर्न और वितरण, और उनके प्रतिजन प्रस्तुति और टी सेल सक्रियण क्षमता में । प्रयोगात्मक ट्यूमर मॉडल के अधिकांश टीकाकरण डीसी के लाखों की आवश्यकता के बाद से, वे व्यापक रूप से अस्थि मज्जा या तिल्ली से अलग कर रहे हैं. हालांकि, इन डीसी काफी प्रतिरक्षा परिसरों (आईसी) को अपनी प्रतिक्रियाओं में रक्त और ट्यूमर डीसी से अलग है, और संभवतः अंय Syk-युग्मित लेक्टिन रिसेप्टर्स के लिए । महत्वपूर्ण बात, खतरे के लिए डीसी की संवेदनशीलता को देखते हुए जुड़े अणुओं, endotoxins या एंटीबॉडी की उपस्थिति है कि crosslink सक्रियकरण रिसेप्टर्स अलग कदम में से एक में डीसी की भड़काना में परिणाम सकता है और इस तरह के मापदंडों को प्रभावित, या कम से खुराक, उन्हें सक्रिय करने के लिए आवश्यक. इसलिए, यहां हम रक्त और ट्यूमर से MoDC अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हुए उनके समयपूर्व सक्रियण से परहेज । इसके अलावा, एक प्रोटोकॉल ट्यूमर आईसी के साथ MoDC सक्रियण के लिए प्रदान की जाती है, और उनके बाद विश्लेषण ।
Introduction
उनकी खोज के बाद से, वृक्ष कोशिकाओं (डीसी) अपने अद्वितीय टी सेल भेदभाव को तिरछा करने की क्षमता के कारण व्यापक अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है1। पिछले कई दशकों में, एक व्यापक अनुसंधान के प्रयास के लिए विभिंन डीसी सबसेट और उनके समारोह ट्यूमर प्रगति और प्रतिरक्षा 2के दौरान परिभाषित करने की मांग की है । dc विषम कोशिका आबादी है कि उनके पैटर्न में एक दूसरे से अलग पहचान रिसेप्टर्स, ऊतक वितरण, और प्रवासी और प्रतिजन प्रस्तुति क्षमताओं3,4,5से बना रहे हैं । अन्य डीसी सबसेट की तुलना में, monocyte-व्युत्पन्न डीसी (MoDC) ट्यूमर में कहीं अधिक प्रचुर मात्रा में हैं और आसानी से परिसंचारी या ट्यूमर घुसपैठ monocytes6,7से उत्पन्न किया जा सकता है. इसलिए, कई नैदानिक अपने रिश्तेदार की व्यापकता का लाभ लेने की मांग परीक्षण vivo में पर आधारित है और ऑटोलॉगस MoDC के पूर्व vivo हेरफेर के लिए टी सेल उन्मुक्त 8,9में ।
इसी तरह, प्रायोगिक ट्यूमर मॉडलों के डीसी आधारित टीकाकरण 2-3 सीरियल इंजेक्शन, 5-7 दिन के अलावा, 1-2 x 106 सक्रिय डीसी ट्यूमर एंटीजन के साथ स्पंदित की आवश्यकता है । इसलिए, डीसी के इस बड़ी संख्या को प्राप्त करने के लिए, सबसे माउस अध्ययन मुख्यतः अस्थि मज्जा (बी. ए.) जीएम-सीएसएफ से 7-9 दिनों के लिए (IL-4 माउस की स्थापना में आवश्यक नहीं है) में MoDC संस्कृति का इस्तेमाल किया है10,11। बहरहाल, यह देखते हुए कि जीएम सीएसएफ नॉकआउट चूहों समग्र सामांय डीसी डिब्बे 12,13है, और मिश्रित है कि संस्कृति से प्राप्त की आबादी,14 इन डीसी के शारीरिक प्रासंगिकता सवाल में कहा गया है दिया ।
वैकल्पिक रूप से, डीसी नियमित रूप से तिल्ली कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है । हालांकि, dc केवल के बारे में 0.3-0.8% कुल तिल्ली कोशिकाओं (लगभग 7 x 105 dc/तिल्ली), और इन कोशिकाओं के, केवल CD103+ dc और MoDC वापस लसीकावत् अंगों के लिए माइग्रेट कर सकते हैं में शामिल हैं । चूंकि MoDCs प्लीहा डीसी की आबादी के लगभग 10-15% शामिल15,16, सबसे अलगाव प्रोटोकॉल लगभग 1 x 10 तिल्ली प्रति5 MoDC उपज । MoDC का विस्तार transfected B16 कोशिकाओं है कि जीएम सीएसएफ स्रावित इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, एक १०० प्लीहा MoDC में वृद्धि गुना में जिसके परिणामस्वरूप17। हालांकि, डीसी टीके के विकास के लिए MoDC के उपयोग के बाद से इस प्रक्रिया मनुष्यों में नहीं किया जा सकता है और प्राप्त MoDC पहले से ही उच्च सक्रिय है सीमित है ।
डीसी की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के अलावा, ऑटोलॉगस कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ प्रभावी डीसी टीके के विकास के लिए एक और चुनौती ट्यूमर सेटिंग में पर्याप्त खतरे संकेतों की कमी को पूरी तरह से सक्रिय डीसी शामिल है । सह stimulatory संकेतों की प्रेरण आमतौर पर पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स (पीआरआर), या सी प्रकार लेक्टिन संकेतन रास्ते18,19,20,21के सक्रियण के माध्यम से प्राप्त की है । डीसी सक्रिय करने के लिए एक और दृष्टिकोण अपने एंटीजन को सतह Fcγ रिसेप्टर्स (FcγR) के साथ बातचीत के माध्यम से लेने की क्षमता कारनामे । दरअसल, महत्वपूर्ण पांडुलिपियों के एक नंबर है कि ट्यूमर के साथ सक्रिय बीएम पुरोगामी से MoDC के इंजेक्शन आईजीजी आईसी नियत्रंण सेटिंग्स में ट्यूमर के विकास को रोका जा सकता है पता चला है, और स्थापित ट्यूमर के उंमूलन के लिए नेतृत्व कर सकते है22,23 .
हाल के दो पत्रों में, कर्ंमी एट अल. पता चला है कि इसके विपरीत में BMDC और तिल्ली डीसी, रक्त और ट्यूमर से MoDC अतिरिक्त उत्तेजनाओं के बिना आईजीजी आईसी का जवाब नहीं कर सकते । यह FcγR संकेतन24,25को विनियमित करने के tyrosine phosphatases के उच्च intracellular स्तर की उपस्थिति के कारण पाया गया । डीसी में एक महत्वपूर्ण चौकियों को परिभाषित करके, यह काम सफल डीसी आधारित टीकाकरण के लिए आवश्यकताओं में एक महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है । अतिरिक्त उत्तेजनाओं के लिए आवश्यकता FcγR संकेतन सक्षम करने के लिए, और संभवतः अंय लेक्टिन एक समान फास्फारिलीकरण झरना का उपयोग रिसेप्टर्स से संकेत, इस प्रकार अपने अलगाव के दौरान डीसी की भड़काना से बचने के लिए की जरूरत को रेखांकित करता है ।
इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल रक्त और ट्यूमर से MoDC के अलगाव का वर्णन करता है, जो बीएम और तिल्ली डीसी से स्पष्ट रूप से अलग है, और इस प्रक्रिया के दौरान विचार करने के काबिल सावधानियों पर प्रकाश डाला गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीसी की बड़ी संख्या को देखते हुए टीका लगाने चूहों के लिए आवश्यक (लगभग 2-4 x 10 6 एक माउस प्रति डीसी), चूहों में टीकाकरण रणनीतियों के अधिकांश बीएम और उनके पूर्व vivo सक्रियण द्वारा पीछा तिल्ली से डीसी के अ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
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