Et Microbiomechanical System for å studere Varicosity formasjon og utvinning i sentrale Nevron Axons
Summary
Denne protokollen beskriver en fysiologisk relevant, trykksatt væske tilnærming for rask og reversibel induksjon av varicosities i neurons.
Abstract
Axonal varicosities er forstørret strukturer langs skaft av axons med en høy grad av heterogenitet. De finnes ikke bare i hjernen med nevrodegenerative sykdommer eller skader, men også i normal hjernen. Her beskriver vi en nyopprettede micromechanical systemet raskt, pålitelig og reversibel indusere axonal varicosities, tillater oss å forstå mekanismene som styrer varicosity formasjon og heterogene protein komposisjon. Dette systemet representerer en roman betyr å evaluere effekten av komprimering og skjær stress på forskjellige subcellular deler av neurons, forskjellig fra andre i vitro systemer som hovedsakelig fokuserer på effekten av strekking. Viktigere, på grunn av de unike funksjonene til systemet gjort vi nylig et romanen funn viser at programmet trykksatt væske kan raskt og reversibel induserer axonal varicosities gjennom aktivering av en forbigående reseptor potensielle kanal. Biomekaniske systemet kan benyttes enkelt i kombinasjon med narkotika perfusjon, levende celle bildebehandling, kalsium bildebehandling og patch klemme opptak. Denne metoden kan derfor vedtas for å studere mechanosensitive ionekanaler, axonal transport regulering, axonal cytoskjelett dynamics, kalsium signalering og morfologiske endringer relatert til traumatisk hjerneskade.
Introduction
Varicosity formasjon eller hevelse/beading, langs axons, er et fremtredende trekk ved neurodegeneration observert i mange lidelser eller skader av det sentrale nervesystemet, inkludert multippel sklerose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, og traumatisk hjernen skade1,2. Til tross for betydelige fysiologiske virkningene av axonal varicosities på handlingen potensial forplantning og synaptic overføring3er hvor varicosities genereres ukjent. Nylig fant bruker en nyopprettede microbiomechanical analysen på kulturperler hippocampus neurons fra gnagere, vi at mekanisk stimuli kan indusere varicosities i disse neurons med svært spennende funksjoner. Først varicosity induksjon er rask (< 10 s) og denne prosessen er uventet reversibel. Andre varicosity innvielsen avhenger av styrken puffing Press: Jo høyere trykket, jo raskere oppstart. Tredje varicosity innvielsen, avhenger av neuronal alder. Axons yngre neurons vises mer mottagelig for mekanisk stress, sammenlignet med de eldre neurons. Fjerde, viser skjemaet varicosities langs axons hippocampus neurons, mens dendrites og første axon segmenter av disse neurons ingen endring under forutsetning av samme puffing. Dermed avdekket vår studie en roman trekk av neuronal polaritet. Disse funnene med i vitro systemet er fysiologisk relevante. Bruker en i vivo modell for mild traumatisk hjerneskade (mTBI), viste vi at axonal varicosities utviklet i Multi-Focal mote i somatosensory cortex av mus umiddelbart etter Lukk-skallen innvirkning, forenlig med våre i vitro resultater4. Det er viktig å merke seg at vårt flekker og bildebehandling av mTBI mus bare gir snap shot av nevrale morfologiske forandringer, siden utfører i vivo tidsinnstilt bildebehandling av neuronal morfologi under en mekanisk effekt er fortsatt ikke mulig.
Væske-damper systemet tillot oss ikke bare å fange unike funksjoner knyttet til mekanisk stress-indusert varicosity formasjonen, men også å bestemme den underliggende mekanismen. Ved å teste ulike ekstracellulære løsninger, stopper og openers forskjellige kandidater mechanosensitive ionekanaler og mobilnettet elektrofysiologi, identifisert vi at forbigående reseptor potensielle kasjon kanal gruppe V medlem 4 (TRPV4) kanal som er permeabel Ca2 + og Na+ og aktivert ved puffing er hovedsakelig ansvarlig for å oppdage første mekanisk stress under axonal varicosity formasjon4. Dette ble ytterligere bekreftet med siRNA knockout tilnærming. Tatt sammen dette nye analysen systemet vi har utviklet med hippocampus Nevron kultur, er svært verdifull for å studere micromechanical egenskapene til sentrale neurons, spesielt i kombinasjon med andre teknikker.
Micromechanical systemet har vi etablert er unik og forskjellig fra tidligere eksisterende systemene i flere viktige aspekter. Først i dette systemet oppleve neurons ut-av-plane mekanisk stress i form av komprimering og skråstilling. Under den mekaniske påkjenninger, neuronal prosesser være knyttet til dekkglassvæske overflaten og flytte ikke. Dette er forskjellig fra andre eksperimentelle systemer som hovedsakelig involvert bøying og strekking i flyet (eller spenning), for eksempel nedbøyning av medfølgende axons som flytte strenger5,6 eller strekke axons dyrket på micropatterned kanaler og elastisk membraner7,8. Videre, selv om axonal varicosities kan også bli indusert i disse analyser som i væske-damper systemet, prosessen i disse innstillingene tar mye mer tid (fra 10 minutter til flere timer6,7,8) og vises irreversible. Til slutt systemet bruker lokale væske puffing tillater undersøkelse av romlige funksjonene til varicosity dannelse (f.eks., dendrites, dendrittiske spines, soma, axonal første segmenter, axonal terminaler), foruten dens timelige funksjoner. Bruke dette systemet, oppdaget vi flere uventede og unike funksjoner i axonal varicosity formasjon, spesielt raskt innsettende, langsom Reversibilitet og axon-dendrite polaritet.
Systemet som vi diskutere i dette papiret er kompatibel med mange teknikker av molekylære og cellen biologi. For eksempel for å studere effekten av mekanisk stress på neuronal morfologi og funksjon, kan det brukes sammen med myelin coculture, time-lapse imaging fluorescerende resonans energioverføring (bånd) og total intern refleksjon fluorescens (TIRF), kalsium bildebehandling, og oppdateringen klemme opptak. I dette papiret fokusere vi på de viktigste komponentene i systemet. Hippocampus Nevron kultur, væske-damper oppsett, høyoppløselig tidsinnstilt bildebehandling axonal transport og kalsium imaging illustrert trinnvise nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prosedyren for denne microbiomechanical analysen er rett frem. Det vil gi pålitelige resultater, hvis alle trinn gjennomføres nøye. Det er flere viktige ting, hvis feilaktig utført, vil hindre vellykket datainnsamling. De avgjørende skritt begynne oppstrøms av faktiske puffing stimulans. Forsiktig disseksjon, dyrking og pleie av primære Nevron kultur er viktig. Hvis kulturperler neurons ikke er sunt, reagere de ikke konsekvent, siden de kanskje har allerede blitt primet for stress. Nedstrøms kulturen, grunninstal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle dyr forsøk har vært gjennomført nasjonale institutter for helse dyr bruk retningslinjer. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R01NS093073 og R21AA024873) til C. Gu.
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
