Her presenterer vi upartiske kvantifisering av områdespesifikke protein acetylation og/eller succinylation belegget (støkiometri) av en hel proteom gjennom en ratiometric analyse av endogene endringer endringer introdusert etter kvantitative kjemiske acylation med stabil isotop-merket anhydrider i form. I kombinasjon med sensitive data uavhengig oppkjøpet massespektrometri hentes akkurat sted bruk målinger.
Post-translasjonell modifikasjon (PTM) av protein lysin rester av NƐ– acylation induserer strukturelle endringer som kan dynamisk regulere protein funksjoner, for eksempel ved å endre enzymatisk aktivitet eller formidling interaksjoner. Presis kvantifisering områdespesifikke protein acylation belegg eller støkiometri, er viktig for å forstå funksjonelle konsekvensene av både globale lavt nivå støkiometri og personlige høyt nivå acylation støkiometri av bestemte lysin rester. Andre grupper har rapportert måling av lysin acetylation støkiometri ved å sammenligne forholdet mellom peptid forløper isotoper fra endogene, naturlige overflod acylation og eksogene, tunge isotop-merket acylation introdusert etter kvantitative kjemiske acetylation proteiner med stabil isotop-merket eddiksyre. Denne protokollen beskriver en optimalisert tilnærming med flere forbedringer, inkludert: (1) økt kjemiske acylation effektivitet, (2) muligheten til å måle protein succinylation i tillegg til acetylation, og (3) forbedret kvantitative nøyaktighet grunn redusert interferens med fragment ion kvantifisering av data-uavhengig oppkjøp (DIA) i stedet for forløper ion signalet fra data-avhengige oppkjøp (“BMH”). Bruk av utdraget peak områder fra fragment ioner for kvantifisering kan også unik differensiering av områdenivå acylation støkiometri fra proteolytisk peptider som inneholder mer enn én lysin rester, som ikke er mulig å bruke forløper ion signaler for kvantifisering. Datavisualisering i silhuett, en åpen kildekode kvantitative Proteomikk miljø, gir praktisk data inspeksjon og gjennomgang. Sammen, tilbyr denne arbeidsflyten upartisk, presis og nøyaktig kvantifisering av områdespesifikke lysin acetylation og succinylation belegg av en hel proteom, som kan avsløre og prioritere biologisk relevante acylation områder.
NƐ– acylation av protein lysin rester er en viktig regulator av protein-funksjonen. Lysin acetylation og andre acylations, som succinylation, malonylation og glutarylation, antas å regulere stoffskiftet, celle signalisering og andre cellulære prosesser1,2,3,4 , og har implikasjoner i metabolske forstyrrelser5. Mange studier har funnet at lysin acyl modifikasjoner gjennomgå store fold-endringer under ulike forhold i pattedyr vev og celle linjer5,6,7,8 samt bakterier9,10,11, men endringene relative brett gir innsikt i andelen totale protein endret. Studier målinger av acylation området innkvartering er knappe12,13,14, til tross for relevansen og behov for slike studier som de gir mer detaljert enn relativ fold endre. For eksempel kan en 10 ganger endring representere en nettstedet bruk økning 0,01 0,1%, 1-10% eller selv 10 til 100%. Nøyaktig støkiometri målinger er nødvendig å tolke biologiske betydningen av acylation og forutsi innvirkning om omfanget av protein strukturelle, og muligens funksjonelle endringer.
En tidligere metode å kvantifisere området bruk benytter tunge stabil-isotop kjemiske merking av uforandret lysin rester etterfulgt av massespektrometri å måle forholdet mellom endogen “lys” acetylation i forhold til den ytre, kjemisk-merket “tunge” acetyl-lysine med forløperen ion intensiteter12. En fersk studie av Zhou et al. 13 beskrevet en lignende tilnærming for å vurdere lysin acetylation støkiometri som også ansatt en komplett kjemiske acetylation av alle uforandret lysin rester i proteiner med stabil isotop merking, men brukt fragment ion intensiteter målt ved DDA. Nakayasu et al. 14 brukt en lignende DDA tilnærming, men i stedet brukes forholdet mellom lette og tunge acetyl-lysine immonium ioner for kvantifisering. Kvantifisering basert på fragment ioner, immonium eller sekvens ioner (MS2), i de fleste tilfeller fører til mindre signal forstyrrelser i forhold til behandling intakt peptid forløper ioner (MS1). Imidlertid kan kvantifisering fragment ioner fra DDA generert MS-/ MS spectra lide av Stokastisk sampling mangler, hvor høy-overflod forløper ioner er mer sannsynlig å bli valgt for MS-/ MS og dermed føre til en partisk og ufullstendig utvalg av forløperen ioner.
Denne romanen arbeidsflyt4 (figur 1) bruker konseptuelt en stabil isotop kjemiske merking tilnærming opprinnelig utviklet av Baeza et al. 12, men arbeidsflyten senere kombinert med DIA samle begge forløper og flere fragment ion krillens over synlig massen spenner15,16 gir nøyaktig støkiometri beregninger.
Topp områder fra fragmentere ioner som inneholder acylation stedet av interesse, eller ‘skille fragment ioner’, er brukt om å kvantifisere acylation nettstedet belegg (figur 2). Fragment ioner som ikke inneholder endringen har identiske lette og tunge m/z-verdier, og brukes for peptid identifikasjon, men ikke for kvantifisering. Skyline programvare17 brukes til å hente forløper og fragment peak områder. Tilstedeværelsen av flere fragment ioner som inneholder et bestemt acylation område gir fleksibilitet hvis det oppdages forstyrrelser i noen av de fragment ionene. Datavisualisering i Skyline gir kritiske inspeksjon av lett-å-tunge fragment ion prosenter. I tillegg til manuell dataanalyse, ble en åpen kildekode R-pakke skrevet internt StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), utviklet, som bruker den forløper ion og fragment ion data samlet inn gjennom DIA og kvantifiserer stedsbestemte acylation støkiometri fra peptider som inneholder flere lysin rester, en funksjon ikke mulig med forløperen ion-bare intensitet målinger4.
Denne protokollen også demonstrerer bruken av endoproteinase Glu-C, som er spesifikk for C-terminalen cleavage på glutamic og aspartic syre rester, istedet for benytter trypsin eller Arg-C protease, sistnevnte ofte generere svært store og potensielt multiplisere acylated proteolytisk peptider fra blokkert trypsin cleavage på acylated lysin rester. Den kjemiske merking prosedyren ble også utvidet til å inkludere bruk av succinic anhydride (figur 1), og dermed gjør kvantifisering av succinylation støkiometri succinylation. I tillegg til forbedringer eksempel forberedelse, gjennomføring av peptid fraksjoneres av frakoblet, grunnleggende pH, redusert reverseres-fase (bRP) utskillelse av peptider ytterligere kvantifisering forstyrrelser, slik at bedre de convolution av acylation støkiometri i hele proteom prøver. Sammen, denne metoden har, og fremhever flere fordeler: (1) effektivisering av kjemiske acylation; (2) måling av protein succinylation støkiometri i tillegg til acetylation; og (3) forbedret kvantifisering nøyaktighet. Forbedret kvantifiseringen er redusert forstyrrelser i fragment ion signaler fra DIA sammenlignet DDA forløper signalet, så vel som implementeringen av off-line peptid før fraksjoneres av bRP.
Denne protokollen gir en roman og nøyaktig metode for å kvantifisere områdespesifikke lysin acetylation og succinylation belegg som kan brukes på en hel proteom. Denne metoden er avhengig av måling av endogene lys peptider og eksogene tunge peptider, som er generert i vitro kvantitative kjemiske acylation proteiner med deuterated eddiksyre anhydride –d6 eller succinic anhydride –d4 (figur 1). Lignende metoder har brukt stabil isotopanrikning merking av innfødte uforandret lysin rester og utført området bruk kvantifisering basert på enten forløper ion-bare12 eller fragment ioner DDA oppkjøp13,14. Denne protokollen gjelder flere trinn under eksempel forberedelse til å forbedre acylation effektivitet og utvider kjemiske merkingen til succinylation. Datainnsamling bruker DIA oppkjøp henter både forløper ion og MS2 fragment ion intensiteter over hele synlig massen utvalg, dermed redusere fragment ion forstyrrelser. Analyse og kvantifisering via Skyline og egendefinerte skript egenutviklede at nettstedet bruk beregningen for peptider som inneholder mer enn én lysin rester og flere acylation på ett sted.
Det er flere viktige trinn under eksempel forberedelsen scene av denne protokollen som bør følges nøye. Siden hele protokollen er avhengig av effektiv kjemisk endring av alle lysin rester, er dette trinnet av største betydning. Anhydrider i form reagerer med gratis aminer, slik som inneholder Amin buffer eller miljøgifter molekyler i protein lysate må unngås. Også under det kjemiske per acylation trinnet, sikre at pH reaksjonsblandingen er justert tilbake til pH 8 etter hver av de tre incubations med anhydride reagenser denne reaksjonen Forsurer blandingen, og O-acylation side-reaksjoner kan danne. Videre er fortynning av 8 M urea inneholder reaksjonsblandingen å rundt 0,8 M urea før fordøyelsen og sjekke at pH er i det optimale området viktig for optimal aktiviteten av endoproteinase Glu-C. En annen viktig del av vår protokollen er datainnsamlingssteg og innføring av en DIA arbeidsflyt, som overvinner alle DDA datastikkprøver inkonsekvenser og gir mulighet for kvantifisering på MS2 fragment ion nivå. En Hovedfordelen av DIA metodikken er reduksjon av forstyrrelser som er vanligvis mye mer utsatt og problematisk når kvantifisere MS1 forløper ion signalet (som noen av de tidligere publikasjonene har foreslått).
Flere endringer i arbeidsflyten kan gjøres når forbereder komplekse eksempler. Antall fraksjoner gruppert etter frakoblede basic-pH reverseres-fase HPLC fraksjoneres kan reduseres for å redusere kompleksiteten i grupperte prøvene som vil bli kjøpt av LC/MS. i tillegg lenger brukt kromatografiske graderinger kan også brukes under oppkjøpet å gi bedre peptid separasjon. Alternativt kan flere proteaser brukes å fordøye prøver å produsere et større utvalg av kløyvde peptider og øke dekning av protein lysin rester. Prøveperioden løper og optimalisering kan utføres ved hjelp av kommersielle BSA som inneholder bestemte prosentandeler av acetylation eller succinylation.
En begrensning til denne protokollen er potensielt svak området bruk overvurdering grunn har nevnt andre lysin endringer, for eksempel metylering eller ubiquitination, etc., på samme sted4. Beregnet fra de høyeste områdene av lette og tunge acyl modifikasjoner, L/(L+H), er området belegget basert på antagelsen at den totale mengden endring hos en lysin består av bare endogene ‘lys’ acylation (L) og kjemisk merket ‘tunge’ acylation (H). Men kan faktisk totalt acylation innholdet på et nettsted i vivo inneholde andre endringer utover acetylation og/eller succinylation. I tillegg rapporterte isotopanrikning renheten av innkjøpte reagenser eddiksyre anhydride –d6 (99%) og succinic anhydride –d4 (> 98%) kan bidra til en liten overvurdering av opp til 2% (succinyl) eller 1% (acetyl) av den endogene acylation nivå4. Sammen disse liten overestimations legge til vanskelighetene i kvantifisere nettsteder med mindre enn 1% bruk. Store mengder forskjellene mellom hele kjemisk acylated peptider og innfødte acylated peptidene også bidra til mulige området bruk kvantifisering feil, spesielt for lav endogene acylated peptider27. En fersk studie av Weinert et al. 27 fant at redusert overflod forskjellene mellom fullført per-acetylated peptider kan redusere de kvantifisering feil27.
Støkiometri quantifications samlet ved hjelp av denne protokollen kan finne viktig acylation hotspots i et bestemt protein og skjemaet hypoteser for biologiske oppfølgingseksperimenter, som nettstedet-rettet mutagenese av bestemte områder av interesse. Denne protokollen kunne også avsløre kombinerte effekten av lav acylation støkiometri nettsteder som kan utøve indirekte eller subtile påvirkninger på protein strukturell stabilitet og lokalisert mobilnettet miljøer. I tillegg vil gjennomføringen av denne protokollen til å måle acetylation og succinylation og andre mulige lysin acylation endringer utover acetylation unikt gi innsikt i dynamisk acylation effekter på proteiner under forskjellige biologiske forhold.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH National Institute av Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer NIH-NIDDK gir R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM ble støttet av et NIH T32 fellesskap (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Forfatterne bekrefter støtte fra NIH delt instrumentering stipend for TripleTOF 6600 systemet ved Buck Institute (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |