Føtal mus kardiovaskulære Imaging ved hjælp af en høj frekvens ultralyd (30 / 45MHZ)

Summary

Høj-frekvens ultralyd billeddannelse af føtal musen har forbedret imaging opløsning og kan give præcise non-invasiv karakterisering af cardiac udvikling og strukturelle mangler. Protokollen beskrevet heri er designet til at udføre tidstro føtal mus ekkokardiografi i vivo.

Abstract

Medfødt hjertefejl (CHDs) er den mest almindelige årsag til barndommen sygelighed og tidlig dødelighed. Prænatal påvisning af de underliggende molekylære mekanismer af CHDs er afgørende for at opfinde nye forebyggende og terapeutiske strategier. Mutant musen modeller er kraftfulde værktøjer til at opdage nye mekanismer og miljømæssige stress modifikatorer, at drive hjerte udvikling og deres potentielle ændring i CHDs. Men bestræbelserne på at etablere årsagssammenhæng af disse formodede bidragydere har været begrænset til histologiske og molekylære undersøgelser i ikke-overlevelse dyreforsøg, i hvilken overvågning de vigtigste fysiologiske og hæmodynamiske parametre er ofte fraværende. Live imaging-teknologi er blevet et vigtigt redskab til at fastslå ætiologien af CHDs. Især ultrasound imaging kan bruges prænatalt uden kirurgisk udsætter fostre, at opretholde deres oprindelige fysiologi samtidig overvåge virkningen af miljømæssige stress på de hæmodynamiske og strukturelle aspekter af hjerte kammer udvikling. Heri, bruger vi højfrekvente ultralyd (30/45) system til at undersøge det kardiovaskulære system i føtal mus på E18.5 i utero ved baseline og som svar til prænatal hypoxi eksponering. Vi demonstrere gennemførligheden af system til at måle hjerte kammer størrelse, morfologi, ventrikel funktion, fostrets hjertefrekvens, og navlestrengen arterie flow indekser og deres ændringer i føtal mus udsættes for systemisk kronisk hypoxi i utero i real tid.

Introduction

Medfødte misdannelser i hjertet er heterogene strukturelle mangler, der opstår i den tidlige hjerte udvikling. Aktuelle tekniske fremskridt af operationelle procedurer har ført til betydelige forbedringer i overlevelsesrater for spædbørn med CHDs^1,2. Livskvalitet er dog ofte kompromitteret sekundært til langvarig hospitalsindlæggelse og behov for iscenesat kirurgisk reparation procedurer^1,2,3,4,5. Prænatal påvisning af de underliggende molekylære mekanismer af CHDs er afgørende for at kunne planlægge tidlige indgreb, til at foretage nye forebyggelsesstrategier og forbedre livslang resultater^6,7.

Selv om flere genetiske og miljømæssige faktorer har været impliceret i CHDs patogenese, stadig oprettelse af kausaliteten et udækket behov for at forbedre diagnostiske, terapeutiske og forebyggende strategier^{1,8,9 ,10,11,12}. Derudover åbner undersøger roller i utero stressfaktorer og epigenetiske modifikatorer nye spillesteder for fremtidige undersøgelser^11,12. Det sidste årti har faktisk oplevet hurtige fremskridt i næste generation sequencing teknologi herunder enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) microarray, hele exome sekvensering og genome-wide methylering undersøgelser, deres udnyttelse i at studere den genetiske årsager til komplekse sygdomme hos mennesker, herunder CHDs^1,8,9,10,11 på vej til at identificere nye mutationer og genetiske varianter, der endnu ikke har været testet for deres sygdomsfremkaldende evne i passende dyremodeller.

Blandt de forskellige sygdom modelsystemer er musen dyremodel valg, ikke kun for at undersøge mekanismerne i CHDs under tidlige cardiogenesis^13,14,15,16, men også at belyse deres indvirkning på hjerte kammer modning og funktion i sen drægtighed i prænatal og perinatal stressfaktorer. Derfor udfører i vivo fænotypiske karakterisering af en mutant føtal mus hjerte, i både tidlige og sene stadier af udvikling, er afgørende for at forstå, hvilken rolle disse genetiske variationer og miljøfaktorer på hjerte udvikling, og den potentielle fremtidige indvirkning på kammer specifikke modning processer i mus.

Tidlig påvisning og præcis diagnose af kardiale defekter under udvikling er afgørende for interventionel planlægning^17,18. At være sikker, enkel, bærbare og repeterbare, er føtal Sonografi faktisk blevet standard imaging teknik for kardiale evaluering i klinikken. Føtale cirkulation vurdering ved hjælp af Doppler ultralyd har været meget anvendt i klinisk praksis ikke kun til påvisning af kardiale defekter, men også til at registrere vaskulær abnormiteter, moderkagen insufficiens og intrauterin vækst restriktioner og vurdere fosterets velbefindende i svar på i utero fornærmelser herunder hypoxæmi, moderens sygdom og narkotika toksicitet^17,18. Sideløbende til sin værdi i evaluering af menneskelige fejl og sygdomme, har ultralyd vurdering af fostrets mus fået stadig større nytte i eksperimentel indstillinger^{19,20,21,22, 23}. Især tillader fosterets hjerte ultralyd (ekkokardiografi) fortløbende i vivo visualisering af udvikle hjertet. Mange eksperimentelle undersøgelser har brugt ultralyd-imaging-teknologi til at observere fostrets hjerte-kar-udvikling i transgene føtal mus. Doppler ultralyd har været særdeles nyttig til at belyse de patofysiologiske parametre som flow mønstre i føtale cirkulation under fysiologiske udfordringer eller sygdom betingelser^10,19. I både mennesker og dyr, kan unormal flow eller ilt blodforsyningen til fosteret skyldes forskellige forhold, der kan forstyrre føtal miljø i utero og påvirke fetoplacental akse, herunder placenta abnormiteter, maternel hypoxi, svangerskabsdiabetes, og farmaceutisk induceret vaskulære konstriktion^15,22. Derfor vil etablere standardiserede metoder til at udføre Doppler ultralyd på føtal mus gevaldig bemyndige fremtidige undersøgelser af CHDs ved at lette overvågning flow mønstre og centrale hæmodynamiske indeks af de hjerte-kredsløb under forskellige stadier af cardiac udvikling i genetiske musemodeller.

Høj frekvens ultralyd har vist sig som et kraftfuldt værktøj til at måle de udviklingsmæssige og fysiologiske parametre af det kardiovaskulære system i musemodeller og menneskelige sygdomme¹⁸. Denne teknologi har været yderligere raffineret i de seneste år. Vi og andre forskere har påvist muligheden for dette system til ultra-høje frekvens ultralyd undersøgelser på føtal mus hjerte^{15,19,20,21,22 ,23}. Systemet er udstyret med Doppler farve flow kortlægning og lineær array transducere, der genererer to-dimensionelle, dynamiske billeder ved høj frekvens (30 til 50 MHz) billedhastigheder. Disse fordele, i forhold til lav frekvens ultralyd systemer og den forudgående generation af høj frekvens ultralyd^21,22, give den nødvendige følsomhed og opløsning for dybdegående vurdering af den føtale kredsløbssygdomme system, herunder omfattende karakterisering af hjertet strukturer, kammer funktion og flow indeks af føtal mus i eksperimentel indstillinger. Heri, skitsere vi metoder for at udføre hurtig vurdering af kardiopulmonale omsætning og feto-placenta omsætning på embryonale dag E18.5 i vivo ved hjælp af en høj frekvens system. Vi valgte en 30/45 MHz transducer, der giver en aksial opløsning af ca 60 µm og en lateral opløsning på 150 µm. Dog kan en højere frekvens transducer (40/50 MHz) blive valgt til at analysere tidligere udviklingsstadier ved at følge en lignende metodisk tilgang. Den valgte M-mode giver mulighed for visualisering af væv i bevægelse på høj tidsmæssige opløsning niveauer (1.000 rammer/s). Endelig vil vise vi gennemførligheden af høj ultralyd for detaljerede omfattende fænotypiske karakterisering af fosterets hjerte-kar-hæmodynamiske status og funktion i mus ved baseline og som svar til prænatal hypoxi stress.

Protocol

University of California, Los Angeles, dyrs pleje og brug Udvalget har godkendt alle procedurer i denne protokol. Forsøgene blev udført som en del af en igangværende undersøgelse under aktive dyr protokoller godkendes af den institutionelle Animal Care og brug Udvalget af University of California, Los Angeles, Californien, USA. Animalske håndtering og pleje efterfulgt standarder i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. 1. forberedelse højfrekvente Ultrasound Imaging System</p…

Representative Results

Statistiske analyser af hjerte og hæmodynamiske indeks blev udført offline. Middel til 5 på hinanden følgende målinger i 3 optimale billeder blev beregnet. Dataene blev udtrykt som betyder ± SEM. Student’s t-test blev anvendt til at udlede tværpolitiske sammenligninger. En P -værdi af ≤0.05 blev anset for statistisk signifikant. Efter den ovennævnte protokol kendetegnet vi virkninger af kronisk udsæ…

Discussion

Kardiovaskulære misdannelser og sygdomme i væsentlig grad påvirkes af genetiske faktorer og miljøelementer¹⁹. Vi har tidligere påvist betydelig indvirkning af maternel kaloriefattige begrænsning, indledt i løbet af andet trimester på feto-placenta kredsløbssygdomme flow og føtal hjertefunktion⁹.

Prænatal hypoksi er en anden fælles stressfaktor under fosterudviklingen, der berører gevaldig feto-placenta fysiologi og kredsløbssygdomme…

Materials

Vevo 2100	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	N/A	High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6)	Charles River Laboratories	N/A	Inbread wild type mouse strain