Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer
Summary
Nøyaktig identifikasjon av satellitt celler er avgjørende for å studere deres funksjoner under ulike fysiologiske og patologiske forhold. Denne artikkelen presenterer en protokoll for å identifisere satellitt celler på voksen Skjelettmuskel deler av immunofluorescence-baserte flekker.
Abstract
Immunofluorescence er en effektiv metode som bidrar til å identifisere ulike celletyper på vev deler. For å studere befolkningen ønsket celle, brukes antistoffer for bestemt celle markører på vev deler. I voksen skjelettmuskulatur er satellitt celler (SCs) stilk celler som bidrar til muskel reparasjon og gjenfødelse. Derfor er det viktig å visualisere og spore befolkningen satellitt cellen under ulike fysiologiske forhold. Hvile skjelettmuskulatur, ligger SCs mellom basale lamina og myofiber plasma membran. En vanlig markør for å identifisere SCs i myofibers eller i cellekultur er sammenkoblet boksen protein Pax7. I denne artikkelen presenteres en optimalisert Pax7 immunofluorescence protokoll på skjelettmuskulatur deler som minimerer uspesifisert flekker og bakgrunn. En annen antistoff som gjenkjenner et protein (laminin) av den basale lamina ble også lagt identifisere SCs. ligner protokoller kan også brukes til å utføre dobbel eller trippel merking med Pax7 og antistoffer for ekstra proteiner av interesse.
Introduction
Skjelettmuskel består av multinucleated muskelceller, kalt myotubes er organisert i myofibers, som genererer kraft og bevegelser gjennom sammentrekning. Mest skjelettlidelser muskler, med unntak av noen craniofacial muskler, er avledet fra en midlertidig embryonale struktur kalt somite1. Myogenic forløper celler delaminate fra den epithelial somite å bli myoblasts. Myoblasts videre differensiere i myocytter at sikringen for å bli myotubes til flere kjerne myofibers. Over prosessen kalles myogenesis og er preget av timelig regulert kontroll av genuttrykk. Myogenic forløpere uttrykke Pax3 og Pax7, mens myoblasts express MyoD og/eller Myf5 og myocytter express myogenin og myosins2,3. Muskelvekst er en prosess der myofibers bli større ved å innlemme flere myonuclei i eksisterende fiber (hyperplasia) og en økning i muskel fiber størrelse (hypertrofi)4. Under muskelvekst er det en bærekraftig kilde myogenic celler som har stamcelleforskningen egenskaper ved at de kan differensiere og selvstendig fornye. Disse cellene kalles satellitt cellene basert på deres fysiske plassering mellom sarcolemma (celle membran av myofiber) og de basale lamina5. SCs kraftig bidra til muskelvekst i juvenile scenen (de første 2-3 uker postnatal mus), men bli quiescent i hviler voksen muskel6. Bemerkelsesverdig, de kan være aktivert på nytt svar på muskel skader og skille ut nye muskelceller å reparere det skadede muskel7.
Egenskapene stamcelleforskningen gjøre studiet av SCs relevant for både grunnleggende muskel biologi og behandling av muskel sykdommer8. Som et resultat har det vært et område av intens gransking i de siste tiårene. En enorm fremgang har blitt gjort i dissekere arvelighetsforskning og epigenetics SCs9,10. Teknikker involvert i isolere og identifisere SCs i situ ble utviklet og optimalisert langs måten11. Immunofluorescent flekker kan identifikasjon av SCs ved bruk av spesifikke antistoffer, inkludert som for Pax7. Imidlertid gjengi knapphet og størrelsen av SCs kombinert med en sterk auto-fluorescens av voksen skjelettlidelser muskelvev visualisering utfordrende. Her beskriver vi en immunofluorescent fargeprotokoll optimalisert for musen muskelvev for Pax7 og basert på en eksisterende metode for sebrafisk muskler12. I tillegg er en Laminin antistoff merket med en distinkt fluorophore ansatt å identifisere de basale lamina som SCs er plassert. Denne protokollen kan konsekvent visualisering av Pax7-positive SCs og myogenic forløpere under alle testet fysiologiske forhold og utviklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Over protokollen var basert på en metode for Pax7/MF20 flekker på sebrafisk Skjelettmuskel12. Løsningene brukt og blokkerer trinnene er identiske eller lignende. Antistoffer brukes er identiske. Justert trinnene var basert på funksjonene i musen muskelvev og SCs. Først Laminin antistoff ble lagt inn i blandingen til å visualisere og kontrollere plasseringen av SCs. Det var spesielt nyttig å telle antall SCs under mikroskopet ved dobbelt filter kuben av 488/555; Dette forbedret sterkt SC-avl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker NIAMS lys tenkelig inndelingen for mikroskop og teknisk hjelp. MF20 og Pax7 antistoffer ble innhentet fra utviklingsmessige studier Hybridoma banken utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdt av departementet av biologisk vitenskap, The University of Iowa, Iowa City. Dette arbeidet ble støttet av Intramural Research Program av NIAMS av National Institutes of Health.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
