In vivo fiberkoblet præklinisk konfokal laserscanning endomikroskopi (pCLE) af hippocampale kapillærer hos vågne mus
Summary
Mens multifotonbilleddannelse kun er effektiv på begrænsede dybder fra vævets overflade, er det muligt at opnå 3 μm opløsningsbilleddannelse i enhver dybde via pCLE. Her præsenterer vi en protokol til udførelse af pCLE-billeddannelse til måling af mikrovaskulær dynamik i hippocampus hos ictal og vildtypemus.
Abstract
Målet med denne protokol er at beskrive fiberoptisk bundtkoblet præklinisk konfokal laserscanning endomikroskopi (pCLE) i sin specifikke anvendelse til at belyse kapillære blodgennemstrømningseffekter under anfald, drevet af vægmalericeller. In vitro og in vivo kortikal billeddannelse har vist, at kapillære indsnævringer drevet af pericytter kan skyldes funktionel lokal neural aktivitet såvel som fra lægemiddelapplikation hos raske dyr. Her præsenteres en protokol om, hvordan man bruger pCLE til at bestemme mikrovaskulær dynamiks rolle i neural degeneration i epilepsi ved enhver vævsdybde (specifikt i hippocampus). Vi beskriver en nakkestøtteteknik, der er blevet tilpasset til at registrere pCLE hos vågne dyr for at imødegå potentielle bivirkninger af anæstetika på neural aktivitet. Ved hjælp af disse metoder kan elektrofysiologiske og billeddannelsesoptagelser udføres over flere timer i dybe neurale strukturer i hjernen.
Introduction
I modsætning til andre mikroskopiske billeddannelsesmetoder 1,2,3,4,5,6,7,8 tillader in vivo fiberoptisk baseret konfokal mikroskopi måling af blodgennemstrømningsdynamik i ethvert hjerneområde, i enhver dybde, ved høj hastighed (op til 240 Hz afhængigt af synsfeltstørrelse 9 ). En fiberoptisk sonde muliggør in vivo konfokal laserscanningsbilleddannelse ved 3 μm opløsning, fordi spidsen af sonden (et linseløst mål, der består af et bundt af individuelle fibre med en diameter på 5000-6000 3 μm) kan placeres med en mikroelektrodes nøjagtighed inden for 15 μm fra det fluorescerende mål af interesse. Som med in vivo to-foton-billeddannelse skal fluoroforer tidligere introduceres i billeddannelsesmålet. For eksempel kan fluorescein dextran (eller kvantepunkter) injiceres i vaskulaturen, eller genetisk kodede fluorescerende proteiner kan transfekteres til celler, eller fluorescerende farvestoffer som Oregon Green BAPTA-1 kan bulk-loades i celler inden billeddannelse.
Nyere forskning ved hjælp af disse teknikker har fundet ud af, at vægmalericellemotoraktivitet, der fører til ictal kapillær vasospasmer – pludselige indsnævringer, der opstår ved vægmalericellernes position under anfald 9 – kan bidrage til neurodegeneration i ictal hippocampus9. Mens tidligere billeddannelsesundersøgelser viste in vitro og in vivo pericytkonstriktioner forbundet med lægemiddelapplikationer 6,7,10,11,12, fandt Leal-Campanario et al. de første tegn på in vivo spontane kapillære indsnævringer i murinhjernen. For at fastslå relevans for human temporal lobe epilepsi studerede de mandlige (P30-40 gamle) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) mus 14,15 (JAX stock #003532), en genetisk model af human episodisk ataksi type 115. Pericytter drev både patologiske og fysiologiske hippocampus vægmaleri vasokonstriktioner9 i de spontant epileptiske dyr og deres vildtype (WT) kuldkammerater. Disse observationer blev gentaget i WT-dyr, der blev epileptiske med kainsyre, hvilket indikerer deres generalisering til andre former for epilepsi. Leal-Campanario et al fastslog desuden ved hjælp af nye stereologiske mikroskopimetoder, at apoptotiske – men ikke sunde – neuroner hos epileptiske dyr var rumligt koblet til hippocampus mikrovaskulaturen. Fordi excitotoksicitet ikke har nogen kendt rumlig tilknytning til vaskulaturen, indikerede dette resultat, at unormal kapillær vasospasmisk iskæmi-induceret hypoxi bidrager til neurodegeneration i epilepsi. Figur 1 viser et skema over den generelle opsætning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi udviklede et hovedhættefastholdelsessystem til samtidige elektrofysiologiske og fiberoptiske pCLE-eksperimenter i vågne mus, hvilket reducerede potentiel responsforurening på grund af anæstetiske lægemidler. Hovedhætten og monteringsapparatet er ligetil at konstruere og kan genbruges til billeddannelseseksperimenter med kronisk vågen adfærd. Vi kontrollerede kvaliteten af optagelserne i forhold til guldstandarden for in vivo mikroskopisk blodgennemstrømningsbilleddannelse, TPLSM.
D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet blev finansieret af en Research Initiative Award fra American Epilepsy Society og en pris fra Arizona Biomedical Research Commission til SLM samt et udfordringstilskud fra Research to Prevent Blindness Inc. til Department of Ophthalmology ved SUNY Downstate Health Sciences University, New York State Empire Innovation Program, og yderligere tilskud fra National Science Foundation (0726113, 0852636 og 1523614), Barrow Neurological Foundation, fru Marian Rochelle, fru Grace Welton og Dignity Health SEED-priser og ved føderale tilskud fra National Science Foundation (0726113, 0852636 og 1523614) og af National Institute of Health (Awards R01EY031971 AND R01CA258021) til SLM og SMC Dette arbejde blev også støttet af kontoret for assisterende forsvarsminister for sundhedsanliggender under pris nr. W81XWH-15-1-0138, til S.L.M. L.-C. blev støttet af et José Castillejo-stipendium fra det spanske undervisningsministerium. Vi takker O. Caballero og M. Ledo for deres tekniske rådgivning og assistance.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
