نموذج أرنب التعبير التحوير دائم في الوريد للشريان السباتي المشترك فاصلة الطعوم
Summary
يصف هذا الأسلوب موضع الفاصلة الوريد الطعوم في الأرانب، وتوصيل الطعوم، وتحقيق التعبير التحوير دائمة. وهذا ما يسمح التحقيق في أدوار الفسيولوجية والمرضية المتسلسلات ومنتجاتها البروتين في عروق المطعمة، واختبار للعلاج الجيني لمرض الابتزاز المنوال.
Abstract
الابتزاز المنوال سيخضع لعملية جراحية لعلاج مرض الانسداد الشرياني؛ المشتركة ومع ذلك، يقتصر النجاح على المدى الطويل فشل الابتزاز بسبب تجلط الدم، وتضخم إينتيمال وتصلب الشرايين. والهدف من هذه المادة هو عرض أسلوب لوضع الطعوم فاصلة وريدي الثنائية في أرنب، ثم ترانسدوسينج الطعوم مع ناقل نقل جينات يحقق التعبير التحوير دائمة. يسمح الأسلوب التحقيق في أدوار البيولوجي للجينات ومنتجاتها البروتين في التوازن الابتزاز المنوال العادي. كما أنه يتيح اختبار المتسلسلات للأنشطة التي يمكن أن تمنع الوريد الاختلاس الفشل، على سبيل المثال-، ما إذا كان التعبير عن التحوير يمنع نمو نيوينتيمال، ويقلل من التهاب الأوعية الدموية، أو يقلل من تصلب الشرايين في الأرانب تغذية مع اتباع نظام غذائي عالي الدهون. أثناء جراحة بقاء أولية، اقتطعت الجزء من اليمين واليسار الخارجية حبل الوريد ووضعها على الصعيد الثنائي كنهاية إلى جانب الشريان السباتي المشترك المعكوسة فاصلة الطعوم. خلال عملية جراحية بقاء ثانية، يؤديها 28 يوما في وقت لاحق، كل من الطعوم يتم عزل من الدوران مع مقاطع الأوعية الدموية ولومن شغل (عن طريق أرتيريوتومي) مع محلول يحتوي على ناقل (حداد) أدينوفيرال تعتمد على مساعد. بعد حضانة 20 دقيقة، حل المتجهات ويستنشق، أرتيريوتومي يتم إصلاح واستعادة التدفق. يتم حصاد الأوردة في نقاط زمنية تمليها البروتوكولات التجريبية الفردية. التأخير مدة 28 يوما بين موضع الابتزاز وتوصيل ضروري لضمان تكييف الابتزاز المنوال للدورة الدموية الشريانية. ويتجنب هذا التكيف الفقدان السريع للتعبير التحوير الذي يحدث في الوريد ترقيع ترانسدوسيد قبل أو بعد التطعيم مباشرة. الأسلوب فريد في قدرته على تحقيق التعبير التحوير دائم ومستقر في عروق المطعمة. مقارنة بنماذج الابتزاز المنوال الحيوانات الكبيرة الأخرى، الأرانب بمزايا منخفضة التكلفة وسهلة المناولة. بالمقارنة مع نماذج الابتزاز المنوال القوارض، الأرانب لها أكبر وأسهل للتعامل مع الأوعية الدموية التي توفر الأنسجة الوفيرة للتحليل.
Introduction
تصلب الشرايين هو مرض التهاب مزمن الذي تراكم في الدهون والتهاب في جدار الأوعية الدموية تؤدي إلى تضييق التجويف السفينة والنوبات القلبية والسكتات الدماغية وفقدان أطرافه1،2. التدخلات عن طريق الجلد (على سبيل المثال-، القسطرة والدعامات) والعلاج الطبي (مثلاً.، وكلاء statins و antiplatelet) علاج مفيد لتصلّب الشرايين؛ ومع ذلك، أنها غالباً غير فعالة في علاج مرض الانسداد الحاد سواء في التداولات الشرايين التاجية والطرفية. تجاوز التطعيم، باستخدام شرائح الوريد الغازي، وما زال إجراء مشترك لعلاج المرضى الذين يعانون من منتشر شديد، وأمراض الأوعية الدموية التاجية والطرفية3،4. بيد الوريد الطعوم توضع في التاجي كلا والتداولات الطرفية الفقيرة معدلات سالكيه طويلة الأجل. في تداول التاجية، التي تغطي حوالي 10-20% المنطلق الطعوم هي تغطي في السنة 1 و 50% قبل 10 سنوات5،6. في تداول هامشية، هي معدلات فشل الابتزاز المنوال 30-50% في 5 سنوات7.
العلاج الجيني نهج جذابة لمنع فشل الابتزاز المنوال نظراً لأنه يمكن تسليم منتج جين علاجي تحديداً في الموقع لهذا المرض. وبناء على ذلك، اختبرت العديد من الدراسات الإكلينيكية الوريد الاختلاس الجينات العلاج8،9. ومع ذلك، أساسا جميع هذه الدراسات قد فحص نجاعة في أوائل الوقت نقاط (2-12 أسبوعا)10،11،،من1213،14،15، 16 , 17-ونحن على علم بأية أدلة على أن التدخلات العلاج الجيني يمكن أن توفر دائم الحماية (سنوات) من أواخر فشل الابتزاز المنوال الذي ينتج عادة من تضخم وتصلب الشرايين نيوينتيمال4. قمنا بتطوير أسلوب يتيح التعبير التحوير دائم في عروق المطعمة، ومما يسمح اختبار تدخلات العلاج الجيني في النقاط الزمنية المتأخرة فضلا عن أوائل. تحقيق التعبير التحوير دائم، يتضمن الأسلوب ناقلات حداد واستراتيجية توصيل المتأخر. توفير ناقلات حداد التعبير التحوير المطول لأنهم يفتقرون إلى المورثات الفيروسية، منع الاعتراف (ورفض) من الخلايا ترانسدوسيد18،المناعي19،20، 21-تأخر توصيل (المنجزة 28 يوما بعد إيداع الاختلاس) يمنع فقدان الخلايا ترانسدوسيد أثناء عملية أرتيرياليزيشن التي تحدث مبكرا بعد تطعيم22.
أساليب أخرى تحقق التعبير التحوير العلاجية في الجدار الابتزاز المنوال تعتمد على توصيل الابتزاز المنوال في وقت الفساد موضع10،11،،من1215،16 ،17. عندما تقاس متسلسل، رفض التعبير التحوير باستخدام هذا النهج بسرعة بعد توصيل22،23. تبعاً لذلك، لم تقم دراسة الدراسات باستخدام هذا النهج الفعالية تتجاوز 12 أسبوعا بعد التطعيم الوريد، مع آخر لا تقييم فعالية تتجاوز 4 أسابيع. وفي المقابل، يحقق لنا أسلوب الابتزاز المنوال التعبير التحوير التي استمرت ستابلي ل 24 أسبوعا على الأقل، وعلى أساس دراسات مماثلة تجري في الشرايين المحتمل تستمر وقتاً أطول بكثير من،من2224. ونحن ندرك لا الأخرى المنطلق الاختلاس الجينات العلاج التدخل الذي يحقق التحوير مستقرة في التعبير عن هذه المدة.
استخدمنا نموذج أرنب لتطوير أسلوب لدينا. البعض الآخر قد استخدمت القوارض، الأرانب، أو الحيوانات الكبيرة لاختبار المنطلق graft الجينات العلاج10،11،،من1215،16،17،25، 26. بالمقارنة مع نماذج القوارض، الأرانب هي أكثر تكلفة وتخضع لمتطلبات تنظيمية أكثر صرامة. بيد أن المقارنة للحيوانات الكبيرة (على سبيل المثال. والخنازير والكلاب)، الأرانب أقل تكلفة لشراء والبيت وأسهل بكثير للتعامل مع. وعلاوة على ذلك، تشبه الأرنب سفن سفن البشرية فسيولوجيا27، فكبيرة بما فيه الكفاية أن يمكن استخدامها لاختبار التدخلات عن طريق الجلد28،29، وأنها توفر الأنسجة كافية نقاط نهاية متعددة (مثلاً.، علم الأنسجة، والبروتين، الحمض النووي الريبي) يمكن دراسة استخدام22،30عينة واحدة من الأوعية الدموية. وبالإضافة إلى ذلك، عندما يتم تغذية الأرانب مع الطعوم الوريد مع اتباع نظام غذائي عالي الدهون، يطورون الوريد الاختلاس تصلب الشرايين31،32، وسبب شائع للشريان التاجي الالتفافية الوريد الاختلاس فشل4،5 . يمكن أن تخدم هذه الطعوم الوريد أرنب تصلب الشرايين كركيزة لاختبار تدخلات العلاج الجيني تسليمها مع هذا الأسلوب. بروتوكول المتوفرة يمكن أن تساعد المحققين لإتقان المهارات التقنية اللازمة لتحقيق التعبير التحوير دائم في ترقيع الوريد أرنب.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول إدارة التخدير، والتلاعب التخثر والجراحية الوريد الشريان/المطعمة، والقياسات الفسيولوجية الوريد المطعمة. الإدارة السليمة للتخدير الحاسم في هذا الطراز جراحة بقاء متعددة تتضمن عمليتين من عمليات طويلة نسبيا (عادة من 3 إلى 3.5 ح لتطعيم ثنائية الاتجاه وح …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -. H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
