Een konijn Model van duurzaam transgenic expressie in de halsslagader aan gemeenschappelijke halsslagader spreekbeurt transplantaten
Summary
Deze methode beschrijft de plaatsing van de spreekbeurt ader enten bij konijnen, de transductie van de transplantaties en de verwezenlijking van duurzaam transgenic expressie. Hierdoor kan het onderzoek van fysiologische en pathologische rollen van transgenen en hun eiwitproducten in geënte aderen, en het testen van gentherapieën voor ader graft ziekte.
Abstract
Ader graft bypassoperatie is een gemeenschappelijke behandeling voor occlusieve arterieel vaatlijden; succes op lange termijn wordt echter beperkt door het transplantaat niet als gevolg van trombose, intima hyperplasie en atherosclerose. Het doel van dit artikel is om aan te tonen van een methode voor bilaterale veneuze spreekbeurt protheses te plaatsen in een konijn, dan transducing de transplantaten met een gen overdracht vector die duurzaam transgenic expressie behaalt. De methode kan het onderzoek van de biologische functies van genen en hun eiwitproducten in normale ader graft homeostase. Hierdoor ook het testen van transgenen voor de activiteiten die ader graft failure, bv voorkomen kunnen., of de uitdrukking van een transgenic voorkomt de groei van de neointimal, vermindert de vasculaire ontsteking of vermindert atherosclerose bij konijnen gevoed met een hoog-vet dieet. Tijdens een eerste overleving chirurgie, zijn de segmenten van de rechter en linker halsslagader externe weggesneden en bilateraal als omgekeerde end-to-side gemeenschappelijke halsslagader spreekbeurt transplantaten geplaatst. Tijdens een tweede overleving operatie, uitgevoerd 28 dagen later, elk van de protheses is geïsoleerd van het verkeer met vasculaire clips en de lumen (via een arteriotomy) zijn gevuld met een oplossing die een helper-afhankelijke adenovirale (HDAd) vector. Na een incubatie 20-min is de oplossing van de vector aanzuiging, de arteriotomy is hersteld, en stroom is hersteld. De aderen worden geoogst op tijdstippen die zijn ingegeven door individuele experimentele protocollen. De 28-daagse vertraging tussen de plaatsing van de prothese en de signaaltransductie is noodzakelijk om de aanpassing van de ader prothese aan de arteriële circulatie. Deze aanpassing voorkomt snelle verlies van transgenic expressie dat zich in de ader transplantaten getransduceerde vóór of onmiddellijk na het enten voordoet. De methode is uniek in zijn vermogen om duurzame en stabiele transgenic expressie in geënte aderen. Vergeleken met andere grote dieren ader graft modellen, hebben konijnen voordelen van lage kosten en gemakkelijk behandeling. Vergeleken met knaagdier ader graft modellen, hebben konijnen groter en gemakkelijker te manipuleren bloedvaten waarmee overvloedige weefsel voor analyse.
Introduction
Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte, waarin lipide accumulatie en ontsteking in de wand van het bloedvat leiden tot vernauwing van het vaartuig lumen, hartaanvallen, beroertes en verlies van ledematen1,2. Percutane interventies (bv., angioplasty en stenting) en medische therapie (bv., statines en antiplatelet agentia) zijn nuttig behandelingen voor atherosclerose; Nochtans, zijn zij vaak ineffectief bij de behandeling van ernstige obstructieve ziekte, zowel bij de coronaire en perifere circulatie. Rondweg enten, met behulp van autogene ader segmenten, blijft een gemeenschappelijke procedure voor de behandeling van patiënten met ernstige, diffuse coronaire en perifere vaatziekten3,4. Echter ader transplantaties in zowel de coronaire geplaatst en perifere circulaties hebben slechte langetermijnrente bij. In de coronaire circulatie, zijn ongeveer 10-20% van de ader transplantaties zijn geroteerd op 1 jaar en 50% geroteerd door 10 jaar5,6. In de perifere circulatie zijn ader graft uitval 30-50% op 5 jaar7.
Gentherapie is een aantrekkelijke aanpak voor de preventie van veneuze graft falen omdat het een therapeutisch gen product precies op de plaats van de ziekte kan leveren. Dienovereenkomstig, talrijke Preklinische studies hebben getest ader graft gene therapie8,9. Echter hebben in wezen alle van deze studies onderzocht de werkzaamheid bij vroege tijd punten (2-12 weken)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. Wij weten geen bewijs dat gentherapie interventies duurzaam kunnen bieden (jaar) bescherming tegen eind ader graft storing, die meestal het gevolg van neointimal hyperplasie en atherosclerose4. Ontwikkelden we een methode die kunt duurzaam transgenic expressie in geënte aderen en waardoor het testen van gentherapie interventies op late evenals vroege tijd punten. Om te bereiken duurzaam transgenic expressie, bevat de methode HDAd vectoren en een vertraagde transductie strategie. HDAd vectoren bieden langdurige transgenic expressie wegens hun gebrek aan virale genen, voorkomen van de erkenning (en de afwijzing) van getransduceerde cellen van het immuunsysteem18,19,20, 21. vertraagde transductie (uitgevoerd 28 dagen na de plaatsing van de prothese) voorkomt het verlies van getransduceerde cellen tijdens het arterialization proces dat vroeg na de praktijk22 plaatsvindt.
Andere methoden die therapeutische transgenic expressie in de ader graft muur bereiken afhankelijk van de transductie van de prothese ader op het moment van het transplantaat plaatsing10,11,12,15,16 ,17. Wanneer gemeten serieel, daalt transgenic expressie met behulp van deze aanpak snel na de signaaltransductie22,2–3. Dienovereenkomstig, studies met deze aanpak niet onderzocht de werkzaamheid buiten 12 weken na de ader enten, met de meeste niet beoordeling van de werkzaamheid buiten 4 weken. Daarentegen onze methode behaalt ader graft transgenic expressie die stabiel gedurende ten minste 24 weken en-op basis van vergelijkbare studies uitgevoerd blijft slagaders waarschijnlijk blijft veel langer22,24. We kennen geen andere ader graft gene therapie interventie die stabiele transgenic uitdrukking van deze duur bereikt.
We gebruikten een konijn model onze methode te ontwikkelen. Anderen hebben knaagdieren, konijnen, gebruikt of grotere dieren voor het testen van de ader graft gene therapie10,11,12,15,16,17,25, 26. Ten opzichte van knaagdier modellen, konijnen zijn duurder en strengere voorschriften gelden. Echter, vergeleken met grotere dieren (bv., varkens en honden), konijnen zijn veel minder duur om te kopen en huis en veel gemakkelijker te hanteren. Bovendien lijken konijn vaartuigen op menselijke schepen fysiologisch27, ze zijn groot genoeg dat ze kunnen worden gebruikt voor het testen van percutane interventies28,29, en ze voldoende weefsel dat bieden meerdere eindpunten (bv., histologie, eiwitten, RNA) kan worden onderzocht met behulp van een enkele bloedvat specimen22,30. Bovendien, wanneer de konijnen met ader transplantaties zijn gevoed met een hoog-vet dieet, ontwikkelen ze ader graft atherosclerose31,32, die is een veelvoorkomende oorzaak van coronaire bypass ader graft failure4,5 . Deze atherosclerotische konijn ader protheses kunnen dienen als substraat voor het testen van gentherapie interventies geleverd met deze methode. Het meegeleverde protocol kunt onderzoekers om de technische vaardigheden nodig zijn om duurzame transgenic expressie in konijn ader transplantaten meester.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in dit protocol omvatten het beheer van de verdoving, anticoagulation, chirurgische manipulatie van de ader slagader/geënt en hemodynamische metingen van de geënte ader. Goed beheer van de verdoving is kritisch in deze overleving chirurgie model met meerdere waarin twee relatief lange bewerkingen (meestal 3-3,5 h voor bilaterale ader enten en 1,5 tot 2,5 h voor bilaterale graft transductie). We hebben toegediend verdoving zowel via een neuskegel Endotracheale intubatie en vond dat de intubatie verbete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -. H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
