En kanin modell av slitesterk Transgene uttrykk i vena jugularis til vanlige arteria carotis Interposition Grafts
Summary
Denne metoden beskriver plasseringen av interposition blodåre graftene i kaniner, signaltransduksjon av graftene og oppnåelse av slitesterk transgene uttrykk. Dette gjør at etterforskningen av fysiologiske og patologiske roller effekter av transgener og deres protein produkter i podet årer og testing av gen-terapi for blodåre pode sykdom.
Abstract
Vene pode bypasskirurgi er en felles behandling for occlusive arterial sykdom; men er langsiktig suksess begrenset av pode dårlig på grunn av tromboser intimal hyperplasia og åreforkalkning. Målet med denne artikkelen er å demonstrere en metode for å plassere bilaterale venøs interposition graftene i en kanin, så transducing graftene med en genet overføring vektor som oppnår holdbar transgene uttrykk. Metoden gjør etterforskningen av biologiske rollene gener og deres protein produkter i normal blodåre pode homeostase. Det kan også testing av effekter av transgener for aktiviteter som kan hindre blodåre pode feil, f.eks., om uttrykk for en transgene hindrer neointimal vekst, reduserer vaskulær betennelse eller reduserer aterosklerose i kaniner matet med en høy-fett diett. Under en innledende overleve kirurgi, er delene av høyre og venstre ytre vena jugularis forbrukeravgift og plassert bilateralt som motsatt ende-til-side felles arteria carotis interposition grafts. Under en andre overleve kirurgi, utført 28 dager senere graftene er isolert fra sirkulasjonen med vaskulær klipp og lumen er fylt (via en arteriotomy) med en løsning som inneholder en hjelper-avhengige adenoviral (HDAd) vektor. Etter en 20 minutters inkubering, vektor løsningen er pustende, arteriotomy er reparert, og strømmen er gjenopprettet. Venene høstes ved tidspunkt diktert av personlige eksperimentelle protokoller. Den 28-dagers forsinkelsen mellom pode plasseringen og signaltransduksjon er nødvendig for å sikre tilpasning av blodåre graftet til arterial sirkulasjon. Denne tilpasningen unngår rask tap av transgene uttrykk som forekommer i blodåre grafts transduced før eller umiddelbart etter pode. Metoden er unik i sin evne til å oppnå varig, stabil transgene uttrykk i podet årer. Sammenlignet med andre store dyr blodåre pode modeller, har kanin fordelene med lave kostnader og enkel håndtering. Sammenlignet med gnager blodåre pode modeller, har kanin større og lettere å manipulere blodårene som gir rikelig vev for analyse.
Introduction
Atherosclerosis er en kronisk inflammatorisk sykdom som lipid akkumulering og betennelser i blod fartøyet veggen føre til innsnevring av fartøyet lumen, hjerteinfarkt, slag og tap av lemmer1,2. PCI tiltak (f.eks., angioplasty og stenting) og medisinsk behandling (f.eks., statiner og antiplatelet) er nyttig behandlinger for aterosklerose; de er imidlertid ofte ineffektive i behandle alvorlig obstruktiv sykdom både i koronar og eksterne rundskriv. Omkjøringsvei pode, bruker gjestfrihet blodåre segmenter, er en vanlig prosedyre for å behandle pasienter med alvorlig, diffus koronar og perifer vaskulær sykdom3,4. Imidlertid vene graftene i både koronar og eksterne rundskriv har dårlige langsiktige patency priser. I koronar sirkulasjon, er ca 10-20% av blodåre grafts er okkludert ved 1 år og 50% okkludert av 10 år5,6. I perifere blodsirkulasjonen er vene pode feilrater 30-50% på 5 år7.
Genterapi er en attraktiv tilnærming for forebygging av blodåre pode feil fordi det kan levere en terapeutisk gene produktet nettopp på stedet av sykdommen. Følgelig har mange prekliniske studier testet blodåre pode gene terapi8,9. Men har egentlig alle disse studiene undersøkt effekten tidlig tid poeng (2-12 uker)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. vi kjenner til ingen bevis for at genterapi intervensjoner kan gi holdbar (år) beskyttelse mot slutten blodåre pode svikt som vanligvis resultatene fra neointimal hyperplasia og aterosklerose4. Vi utviklet en metode som gjør holdbar transgene uttrykk i podet årer, og dermed gjør testing av genterapi intervensjoner på slutten, samt tidlig tidspunkt. For å oppnå varig transgene uttrykk, omfatter metoden HDAd vektorer og en forsinket signaltransduksjon strategi. HDAd vektorer gir langvarig transgene uttrykket fordi de mangler viral gener, hindrer de anerkjennelse (og avvisning) av transduced celler av immunsystemet18,19,20, 21. forsinket signaltransduksjon (utført 28 dager etter pode plassering) hindrer tap av transduced celler under av arterialization som oppstår tidlig etter at pode22.
Andre metoder som oppnå terapeutiske transgene uttrykk i vene pode veggen stole på Albin på blodåre graftet ved pode plassering10,11,12,15,16 ,17. Når målte serielt, avtar transgene uttrykk bruker denne tilnærmingen raskt etter signaltransduksjon22,23. Følgelig har studier med denne tilnærmingen ikke undersøkt effekten utover 12 uker etter venen pode, med mest ikke vurdere effekten utover 4 uker. Derimot vår metoden oppnår blodåre pode transgene uttrykk som vedvarer stabilt i minst 24 uker og-basert på lignende studier utført i arteriene sannsynlig fortsetter langt lengre22,24. Vi kjenner ingen andre blodåre pode gene terapi intervensjon som oppnår stabil transgene uttrykk for denne varigheten.
Vi brukte en kanin modell for å utvikle vår metode. Andre har brukt gnagere, kaniner, eller større dyrene å teste blodåre pode gene terapi10,11,12,15,16,17,25, 26. Sammenlignet med gnager modeller, kaniner er dyrere og er underlagt strengere krav. Men sammenlignet med større dyr (f.eks., griser og hunder), kanin er langt billigere å kjøpe og huset og mye lettere å håndtere. Videre kanin fartøy ligner menneskelige fartøy fysiologisk27, de er store nok at de kan brukes til testing PCI intervensjoner28,29, og de gir tilstrekkelig vev som flere endepunkt (f.eks., histology, protein, RNA) kan undersøkes ved hjelp av en enkelt blodkar prøven22,30. I tillegg når kaninene med blodåre grafts fôres med en høy-fett diett, utvikler de blodåre pode aterosklerose31,32, som er en vanlig årsak til Koronar bypass blodåre pode feil4,5 . Disse aterosklerotisk kanin blodåre grafts kan tjene som et medium for å teste genterapi intervensjoner leveres med denne metoden. Den angitte protokollen kan hjelpe etterforskerne å mestre de tekniske ferdighetene som kreves for å oppnå varig transgene uttrykk i kanin blodåre grafts.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avgjørende skritt i denne protokollen inkluderer håndtering av anestesi, anticoagulation, kirurgisk manipulasjon av arterien/podet venen og hemodynamic målinger av podet venen. Riktig håndtering av anestesi er avgjørende i denne flere overleve kirurgi modellen som inkluderer to relativt lang operasjoner (vanligvis 3-3,5 t for bilaterale blodåre pode og 1.5-2.5 h for bilaterale pode signaltransduksjon). Vi har administrert anestesi både via en nosecone og endotracheal intubasjon og fant at intubasjon bedre overleve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -. H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
