Tillverkning av tunga extracellulära Matrix och beredning av tungan skivepitelcancer In Vitro
Summary
Här visas en metod för beredning av tungan extracellulärmatrix (TEM) med effektiv decellularization. TEM kan användas som funktionella ställningar för återuppbyggnaden av en tunga skivepitelcancer (TSCC) modell statiska eller rörs kultur villkor.
Abstract
För att konstruera en effektiv och realistisk modell för tunga skivepitelcancer cell carcinoma (TSCC) in vitro-, skapades metoderna att producera cell-lösa tungan extracellulär matrix (TEM) som ger funktionella ställningar för TSCC konstruktion. TEM ger en in vitro- nisch för celltillväxt, differentiering och cellmigration. Mikrostrukturer native extracellulär matrix (ECM) och biokemiska kompositioner kvar i cell-lösa matrisen ger vävnadsspecifika nischer för att förankra celler. Tillverkning av TEM kan realiseras av deoxyribonuclease (DNase) matsmältning tillsammans med en allvarlig av organiska eller oorganiska förbehandling. Detta protokoll är lätt att använda och säkerställer hög verkningsgrad för decellularization. TEM visade gynnsamma cytocompatibility för TSCC celler under statiska eller rörs odlingsbetingelser, som möjliggör byggandet av TSCC modellen. En self-made bioreaktor användes också för ihållande rörs villkoret för cellodling. Rekonstruerade TSCC använder TEM visade de kännetecken och egenskaper som liknar kliniska TSCC histopatologi, vilket tyder på en potential i TSCC forskning.
Introduction
Tungan har olika viktiga funktioner, såsom deglutition, artikulation och provsmakning. Således, nedsatt tungan har stor inverkan på patienternas livskvalitet1. Den vanligaste malignitet i munhålan är tungan skivepitelcancer (TSCC), vilket inträffar vanligtvis hos människor som dricker alkohol eller röker tobak2.
Under de senaste åren har små framsteg uppnåtts i grundforskning på TSCC. Bristen på effektiv in vitro- forskning modeller förblir en av de största problemen. Således visar den extracellulär matrixen (ECM) sig vara en möjlig lösning. Eftersom ECM är ett komplext nätverk ramen består av mycket organiserade matrix komponenter, skulle byggnadsställning material med en ECM-liknande struktur och sammansättning vara behöriga för cancerforskning. Cell-lösa ECM kan perfekt ge nischen för cellerna från samma ursprung i vitro, som visar sig vara den mest betydande fördelen med ECM.
ECM kan behållas med cellulära komponenter tas bort från vävnader genom den decellularization som använder tvättmedel och enzymer. Olika ECM komponenter, inklusive kollagen, Fibronektin och laminin i cell-lösa matris ger en native-vävnad-liknande närmiljön för odlade celler, främja den överlevnad, proliferation och differentiering av celler3. Immunogeniciteten för transplantation kan dessutom reduceras till en minimal nivå med avsaknad av cellulära komponenter i ECM.
Hittills, har framställningsmetoder för cell-lösa ECM prövats i olika vävnader och organ, såsom hjärta4,5,6,7, lever8,9,10 ,11, lung12,13,14,15,16,17och njure18,19 , 20. men ingen relevant forskning har hittas på liknande arbete i tungan till bäst av vår kunskap.
I denna studie var cell-lösa tungan extracellulär matrix (TEM) tillverkade både effektivt och billigt av en rad fysiska, kemiska och enzymatisk behandling. Sedan användes TEM att recapitulate TSCC i vitro, visar en lämplig simulering för TSCC beteende och utveckling. TEM har god biokompatibilitet samt förmågan att vägleda cellerna till vävnadsspecifika nisch, vilket indikerar att TEM kan ha stor potential i TSCC forskning3. I protokollet visas här ger ett val för forskare som studerar patogenesen eller kliniska behandlingar av TSCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett väl etablerat protokoll för cell-lösa ECM fabrication bör behålla infödda ECM sammansättning medan du tar bort cellulära komponenter i vävnader nästan fullständigt21. Trots för närvarande rapporterade decellularization protokoll som kräver perfusion via kärlsystemet att ta cellulära material av konvektiv transport, antogs mekaniska agitation här, känd som en traditionell enkel och billig metod22 , 23 , <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stöd av forskningsanslag från National Natural Science Foundation Kina (31371390), programmet för staten High-Tech utvecklingsprojektet (2014AA020702) och programmet för Guangdong vetenskap och teknik (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
