Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Hög genomströmning identifiering av synergistisk läkemedelskombinationer med överlappning2 Metod

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57241
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Immunology Division, Department of Pathology, University of Utah

Summary

Synergistisk läkemedelskombinationer är svårt och tidskrävande att identifiera empiriskt. Här, beskriver vi en metod för att identifiera och validera synergistisk små molekyler.

Abstract

Även om antimikrobiella läkemedel har ökat dramatiskt den livslängd och livskvalitet i de 20- talet, hotar antimikrobiell resistens vår hela samhällets förmåga att behandla systemiska infektioner. I USA ensam döda antibiotikaresistenta infektioner cirka 23.000 personer per år och kostnaden cirka 20 miljarder dollar i ytterligare vård. En strategi för att bekämpa antimikrobiell resistens är kombinationsterapi, vilket är särskilt användbart i det kritiska tidiga skedet av infektionen, innan den infekterande organismen och dess drog resistens profil har identifierats. Många antimikrobiella behandlingar använder kombinationsbehandlingar. Men de flesta av dessa kombinationer är additiva, vilket innebär att den kombinerade effekten är detsamma som summan av de enskilda antibiotisk effekten. Vissa kombinationsbehandlingar är synergistiska: kombinerade effekten är mycket större än additiv. Synergistiska kombinationer är särskilt användbara eftersom de kan hämma tillväxten av antimikrobiella läkemedel resistenta stammar. Dessa kombinationer är dock sällsynta och svåra att identifiera. Detta beror på det stora antalet molekyler som behövs för att testas i ett parvisa sätt: ett bibliotek av 1000 molekyler har 1 miljon potentiella kombinationer. Således har ansträngningar gjorts att förutsäga molekyler för synergy. Denna artikel beskriver vår hög genomströmning metod för att förutsäga synergistisk småmolekylära par kallas den överlappning2 Metod (O2M). O2M använder mönster från kemikalie-genetiska datamängder för att identifiera mutanter som är överkänsliga för varje molekyl i en synergistisk par men inte till andra molekyler. Brun labbet utnyttjar denna tillväxt skillnad genom att utföra en hög genomströmning skärm för molekyler som hämmar tillväxten av mutant men inte vildtyps-celler. Labbets arbete tidigare identifierat molekyler som samverka med den antibiotika trimetoprim och den svampdödande läkemedel flukonazol använda denna strategi. Här presenterar författarna en metod till skärmen för nya synergistiska kombinationer, som kan ändras för flera mikroorganismer.

Introduction

Antibiotikaresistenta bakterier orsakar mer än 2 miljoner infektioner och 23.000 dödsfall årligen i USA enligt CDC1. Nya behandlingar behövs för att övervinna dessa infektioner. Strategier för att identifiera dessa nya behandlingar inkluderar utvecklingen av nya antimikrobiella läkemedel eller återanvända små molekyler som godkänts för andra villkor för att behandla mikrobiella infektioner2,3,4. Ny läkemedelsutveckling är dock mycket kostsamma och tidskrävande. Återanvända droger kan inte identifiera nya läkemedel eller drog mål5,6. Vårt lab fokuserar på en tredje strategi kallas synergistisk kombination terapier. Synergistiska kombinationer uppstå när två små molekyler tillsammans har en effekt som är större än den additiv effekten av deras individuella efficacies7. Dessutom, kan synergistiska kombinationer vara effektiv mot en patogen som är resistent mot en av de små molekylerna i paret förutom att ha mindre oönskade off-target effekter, rendering dem stora potentiella8,9, 10.

Synergistisk par är sällsynta, förekommer hos cirka 4-10% av drogen kombinationer11,12,13. Således, traditionella tekniker såsom parvisa skärmar är utmanande och tidskrävande, med tusentals potentiella kombinationer från ett litet bibliotek av hundra molekyler. Dessutom synergistiska interaktioner vanligen kan inte förutsägas från aktiviteten av föreningar14. Men utvecklat författarna en hög genomströmning till skärmen för synergistisk par, kallas den överlappning2 Metod (O2M)12. Denna metod, som beskrivs här, möjliggör snabbare, effektivare identifiering av dessa synergistiska kombinationer. O2M kräver användning av en känd synergistisk par och en kemisk-genetik-datamängd. Kemisk-genetik datamängder genereras när ett bibliotek av knockout mutanter odlas i närvaro av många olika små molekyler. Om en molekyl i en känd synergistisk par inducerar den samma fenotypen från en viss knockout mutant som andra synergistiska molekylen, bör någon annan liten molekyl som framkallar fenotypen från det samma mutant också samverka med varje medlem av kända synergistisk par. Detta resonemang har använts i brun lab för att identifiera synergistisk antibiotika par aktiva mot Escherichia coli (E. coli) och synergistisk svampdödande läkemedel par aktiva mot patogena svampen Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M är inte bara anpassningsbar för olika patogener, men tillåter för screening av stora bibliotek av molekyler att identifiera synergistisk par snabbt och enkelt. Screening med genetiska mutant identifieras av O2M tillåter oss att validera bara dessa små molekyler som förutspås för synergy. Således, testa en 2.000-molekyl bibliotek pairwise skulle ta månader, om det fanns endast 20 molekyler i det biblioteket som förutspådde för att samverka, testning för synergy nu tar några dagar. O2M kräver inte programmeringskunskaper och utrustningen som behövs finns i de flesta labs eller corefaciliteter. Utöver forskare intresserade av läkemedelskombinationer är O2M analys av intresse för någon som har avslutat en drog skärm och vill expandera sina hits genom att identifiera viktiga läkemedelsinteraktioner. Nedan finns protokollet för att identifiera synergistisk små molekyler i bakterier, samt validera de förutspådda synergistiska interaktioner i välkända analyser15,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. identifiera Synergy förutsägelse mutanter från kemikalie-genetik datamängd genom metoden överlappning2 (O2M)

Obs: Detta är metoden för att identifiera synergy förutsägelse mutanter med publicerade datamängden från Nichols et al. 17 i E. coli. Detta kan dock göras på någon kemikalie-genetik dataset och mikroorganism. Dessa data innehåller ett bibliotek med knockout mutanter vuxit i närvaro av mer än 100 små molekyler, vilket ger en kvantitativ tillväxt Poäng för varje mutant i varje liten molekyl. En synergistisk par måste vara känd, och det bör finnas tillväxt noter för båda små molekyler som ingår i datamängden.

  1. Beräkna det genomsnittliga tillväxt Poäng och standardavvikelsen för alla mutanter som vuxit i närvaro av en enda koncentration av varje liten molekyl.
    Obs: Detta kan göras med någon kalkylprogram. Brun labbet använder Excel och funktionerna =AVERAGE(B3:B3981) och =STDEV(B3:B3981) för beräkningar av varje kolumn i liten molekyl.
    1. Beräkna de medel och standardavvikelser från varje kolumn i liten molekyl, om denna inriktning kan variera om du använder en annan datamängd.
  2. Beräkna Z Poäng för varje koncentration av små molekyler med samma datamängd från Nichols et al. 17 i ett kalkylprogram. För detta negativa z poäng blir Z(2.5) = menar - 2,5 * standardavvikelsen, och positiva z poäng blir Z(2.5) = medelvärdet + 2,5 * standardavvikelsen.
  3. Avgör vilken gen mutanter innehåller betydande Z Poäng i de små molekyler som utgör det kända synergistiska paret, att vara säker på att titta på alla koncentrationer av dessa molekyler. Om tillväxten poäng en mutant är mindre än den negativa Z (2,5) poäng eller är större än de positiva Z (2,5) poängen för den lilla molekylen, anses det betydande.
  4. Avgöra om någon av de betydande gen mutanterna tillhör en operon.
    Obs: För E. coli, författarna rekommenderar kontroll ”Ecoli wiki” information angående om gener transkriberas som en del av en polycistronic RNA.
  5. Identifiera genen/operon mutanter som är gemensamma för majoriteten av de små molekylerna av intresse vid olika koncentrationer (t.ex., när letar efter molekyler som samverka med den antibiotika trimetoprim, identifiera mutanter som visar en betydande Z betyg när den odlas i närvaro av trimetoprim och dess kända synergistiska partners såsom sulfamethizole eller sulfametoxazol). Detta är förmodad synergy förutsägelse mutanter.

2. att förutsäga Synergizers inom den kemiska-genetik datamängden av O2M

  1. Återvänder till dataset17, identifiera varje koncentration av liten molekyl som framkallar en betydande tillväxt Poäng från synergy förutsägelse mutant. Detta görs genom att titta på de Z-poängen beräknas för varje koncentration av små molekyler. Återigen är en betydande tillväxt poäng mindre än den negativa Z-poängen eller högre än den positiva Z-poängen för att koncentrationen av liten molekyl.
    Obs: Om en molekyl visas på ens en av dess koncentrationer, molekylen anses vara en förväntad synergizer. Varje molekyl som inte framkallar en betydande tillväxt Poäng är en förutsedd icke-synergizer.

3. validering av förutsedd synergistiska interaktioner

  1. Att hitta minimal hämmande koncentration (MIC) av förväntade synergizers.
    1. Växer en övernattning kultur av E. coli i M9 minimal media vid 37 ° C.
      Obs: Någon övernattning kultur kan odlas i lämpligt definierade medium för organismen av intresse. Den bruna lab rekommenderar inte rik media LB eller YPD. M9 minimal media består av 10,5 g/L M9 buljong, 0,2% casamino syror, 0.1 M CaCl2, 0,4% glukos, 1 M MgSO4, 0,25% nikotinsyra och 0,33% tiamin i H2O.
    2. Om ingen MIC-data för patogen sevärdheter återfinns i litteraturen vid mottagandet av de små molekylerna, lös i dimetyl sulfoxid (DMSO) på en hög koncentration (> 10 mg/mL).
    3. Använder en plattan med 96 brunnar, tillsätt 100 µL av M9 media till varje brunn. Lägga till en extra 100 µL av M9 media i kolumn 1 så att den innehåller sammanlagt 200 µL.
    4. Lägga till en godtycklig datamängd (~ 10 µL) koncentrerad liten molekyl lösning i kolumn 1. En liten molekyl per brunn av kolumn 1 (8 små molekyler per platta).
      Obs: Dessa är de små molekyler av intresse, som förutspås samverka. Den bruna lab lägger generellt 10 µL av högkoncentrerad småmolekylära lösning, vilket är lägre än beloppet av 100% DMSO som kan hämma E. coli.
    5. När de små molekylerna har lagts till, späd de små molekylerna över x-axeln av plattan. Ta 100 µL lösning från kolumn 1, placera i kolumn 2 och blanda. Ta 100 µL från kolumn 2, placera i kolumn 3 och blanda. Fortsätt tills 100 µL placeras i kolumn 11. Blanda kolumn 11, sedan tar 100 µL från kolumnen och kasta. Lämna kolumnen 12 med bara media att normalisera data.
    6. Inokulera plattan. Skaffa den optiska densiteten (OD600) från en övernattning kultur. Bered en lösning med kultur och M9 media till en OD600 av 0,002 (eller lämplig koncentration som representerar 500 celler/µL för önskad organismen av intresse). Överför med pipett 2 µL kultur lösning till varje brunn av plattan så det finns 1000 celler per brunn.
    7. Försiktigt skaka plattan och få den OD600 för 0 h läsning. Låt plattan växa vid 37 ° C under 24 h. Erhåll OD600 för 24 h läsning.
      Obs: Använd lämpligt odlingsförhållanden för andra organismer av intresse.
    8. Beräkna nettotillväxten för varje väl använda ett kalkylbladsprogram.
    9. Genomsnittliga nettotillväxten av kolumn 12 att få Genomsnittligt ingen drog tillväxt. Normalisera de andra brunnarna med genomsnittet av någon drog tillväxt med ett kalkylprogram. Leta efter någon bra med mindre än 10% tillväxt för att identifiera MIC90. Någon bra med mindre än 50% tillväxt anger MIC50. Beräkna koncentrationen av liten molekyl i dessa brunnar.
  2. Schackrutiga analyser för synergistiska interaktioner
    1. Växer en övernattning kultur av E. coli i M9 minimal media som innan.
      Obs: Använd lämpligt odlingsförhållanden för andra organismer.
    2. Tillsätt 100 µL av M9 media till varje brunn en 96 väl platta och en extra 100 µL i kolumn 1.
    3. Lägg till test små molekylen (på ~ 8 x MIC) till varje brunn i kolumn 1 och lägga dubbla koncentrationen (~ 16 x MIC) till väl A1 (en liten molekyl testat per platta).
      Obs: Detta belopp bestäms från MIC test slutfört föregående och skiljer sig för varje potentiell synergizer.
    4. Skapa en övertoning utspädning på x-axeln genom att ta 100 µL från kolumn 1 och överföra till kolumn 2. Fortsätt tills 100 µL läggs till kolumn 11. Blanda, sedan ta 100 µL från kolumn 11 och kassera. Lägg inte till någon drog i kolumn 12 (figur 1A).
    5. Konfigurera andra toningen som drog över y-axeln för ingående drogen. Tillsätt 100 µL av media som innehåller 2 x mikrofon av ingående molekylen i rad A. Mix och späd som innan, tar 100 µL från rad A och placera i B. Fortsätt tills 100 µL placeras i rad G. Mix, ta 100 µL och kasta, garanterar inte för att lägga till någon ingång drog i rad H. Detta tillåter rad H och kolumn 12 innehålla enskilda mikrofoner av drogen para testade (figur 1B).
    6. Inokulera plattan. Tillsätt 2 µL av en E. coli kultur OD600 0,002 till varje brunn (1 000 celler per brunn).
    7. Mäta den OD600 i varje brunn i plattan för 0 h läsning.
    8. Inkubera plattan för 24 timmar vid 37 ° C.
    9. Mäta den OD600 i varje brunn på 24 h.
  3. Beräkning av indexet fraktionerad hämmande koncentration (FICI) från schackrutigt
    1. Beräkna nettotillväxten för varje brunn av plattan genom att subtrahera den OD600 vid 0 h från OD600 på 24 h i ett kalkylprogram.
    2. Normalisera tillväxten i programvaran genom att dividera varje brunn av väl H12, som innehåller ingen liten molekyl.
    3. Hitta MIC90 av ingående molekylen i kolumn 12 och MIC90 av den potentiella synergisten i rad H.
    4. Leta efter alla brunnar som hämmar 90% av tillväxten.
    5. Beräkna FICI90 för den brunn som är antingen den lägsta nedan (synergistisk) eller högsta ovan (antagonistisk) båda MIC90 värden, med hjälp av ekvation:
      Equation 1
    6. Anser någon FICI ≤ 0,5 så synergistisk och FICI ≥ 4 som antagonistisk (figur 2).
      Obs: Detta kan också göras med MIC50 (50% hämning av tillväxten) att få en FICI50 baserat på dessa MIC-värden.
  4. Bliss oberoende analys
    Observera: Bliss självständighet körs med alla potentiella synergist som inte har en MIC på egen hand.
    1. Växer en övernattning kultur av E. coli i M9 media vid 37 ° C, som tidigare.
      Obs: Igen, lämpliga odlingsförhållanden för andra organismer av intresse kan användas i det här steget.
    2. Förbereda 96 brunnar för att testa potentiella synergistisk molekylen, ingång molekylen, kombinationen och en icke-behandlade kontroll.
    3. Skapa potentiella synergist plattan genom att lägga 50 µL av M9 media till varje brunn. Tillsätt 50 µL av media som innehåller en uppsättning koncentration (10 µM eller 100 µM) den potentiella synergisten till varje brunn på en rad. Testa 8 molekyler per platta.
    4. Skapa ingående molekyl plattan genom att lägga 50 µL av media till varje brunn. Tillsätt 50 µL innehållande 4 x MIC för ingående drogen till varje brunn i kolumn 1. Skapa en övertoning utspädning längs x-axeln liknar MIC plattor, tar 50 µL från kolumn 1, dispergering och blanda i kolumn 2. Fortsätt tills kolumn 12, kassering 50 µL från kolumn 12. Lägga till en ytterligare 50 µL av media till varje brunn så slut summan för varje brunn är 100 µL.
    5. Att skapa kombination plattan med hjälp av en 96 väl plattan, tillsätt 50 µL av media till varje brunn. Tillsätt 50 µL innehållande 4 x MIC för ingående drogen till varje brunn i kolumn 1. Späd längs x-axeln liknar MIC plattor, tar 50 µL från kolumn 1, dispergering och blanda i kolumn 2. Fortsätt detta hela vägen till kolumn 12, kassering 50 µL från kolumn 12. Tillsätt 50 µL av media som innehåller den potentiella synergisten på 10 µM eller 100 µM till varje brunn på en rad. Igen, det bör finnas en koncentration eller drog per rad.
    6. Skapa den icke-behandlade kontrollen genom att tillsätta 100 µL av M9 media till alla brunnar i plattan.
    7. Inokulera alla plattor genom att lägga 2 µL av bakterieodling med en OD600 av 0,002 eller 1000 celler till varje brunn som innan.
    8. Mäta den OD600 i varje brunn vid 0 och 24 h.
  5. Beräkning av Bliss självständighet Poäng
    1. Beräkna nettotillväxten för varje brunn av plattan genom att subtrahera den OD600 vid 0 h från tillväxten på 24 h använda ett kalkylbladsprogram.
    2. Normalisera brunnarna till den genomsnittliga ökningen från ingen drog plattan i ett kalkylprogram.
    3. Med kalkylprogram, beräkna hämning genom att subtrahera nettotillväxten från 1.
    4. Genomsnittliga kolumnerna i kontrollplattan som innehåller endast den ingående lutningen i kalkylprogram.
    5. Beräkna den bliss poängen för varje brunn genom ekvationen:
      Bliss Poäng = (väl X + indatakolumnen X) -kombinerade väl X
    6. Leta efter negativa betyg i brunnar under MIC90 av ingående.
      Obs: Negativa noter över flera koncentrationer skulle innebära en synergistisk interaktion.

4. high-throughput skärm med Synergy förutsägelse mutanter att identifiera roman synergistisk par

  1. Identifiera synergy förutsägelse mutanter
    Obs: Steg 1,5 identifierade förmodad synergy förutsägelse mutanter. Här, bestämma vi vilken av dessa mutanter fungerar bäst i en hög genomströmning skärm för synergistisk droger. Vi utförde denna analys i en Bioscreen maskin, men 96 väl plattan läsare bör också vara acceptabelt.
    1. Växer varje förmodad synergy förutsägelse mutanter och vildtyps-celler i M9 minimal media.
    2. Ställ in 100 honungskaka väl platta (eller 96 väl platta) med lämpligt odlingsmedium, odlingsmedium + ingående drogen, odlingsmedium + kända synergistiska partner av ingående drogen, och odlingsmedium + kända icke-synergistisk drogen. Se till att omfatta fordonets reglage.
      Obs: Vi rekommenderar fyra replikera brunnar för varje stam/läkemedel/koncentration.
    3. Inokulera 1000 celler per brunn, inklusive tomma kontrollbrunnarna.
    4. Växa 48 h vid 37 ° C, med skakningar, och läsa OD600 varje 20 min.
    5. Bestämma drog koncentration och tid punkt som visar största tillväxt skillnaden mellan vildtyp och synergy förutsägelse mutanta celler i närvaro av ingående drogen och dess kända synergistiska partners. Vid optimal tidpunkt och koncentration, bör det inte finnas mycket tillväxt skillnaden mellan vildtyp och synergy förutsägelse mutanta celler när den odlas i närvaro av läkemedel kända för att inte agera synergistiskt med ingående drogen (figur 3).
  2. Hög genomströmning skärmen för synergistisk droger
    1. Växa vildtyp och synergy förutsägelse muterade celler i M9 minimal media.
      Obs: Använd lämpligt odlingsmedium för organismen av intresse.
    2. Lägga till droger från biblioteket i media så varje väl vilket innehåller 100 µL media med små molekyler vid set koncentration som bestämdes i föregående steg. Inkludera tomma brunnar (utan celler) och brunnar med fordonets reglage (e.g., DMSO) att redovisa någon tillväxthämning av läkemedlet utspädning fordonet.
      1. Bered minst fyra fordon kontrollbrunnar per platta, idealiskt spridda över plattan för väl position effekter. Om analyserna är variabel, sedan inkludera minst en fordonskontroll väl per rad/kolumn och använder varje rad/kolumn kontroll samt kontroll för att beräkna Z Poäng för varje rad/kolumn i stället för för en hela plattan (steg 4.2.5).
    3. Tillsätt 2 µL av kultur till varje brunn som innan. (En platta för vildtyp bakterier och en platta för förväntade synergieffekter muterade bakterier).
    4. Bedöma den OD600 vid 0 och 18 h för E. coli eller 48 h för C. neoformans.
    5. Med kalkylprogram, beräkna nettotillväxten genom att subtrahera den OD600 av tomma brunnar från fordon kontrollbrunnarna. Identifiera brunnar med Z-poängen-2,5 (Z Poäng = medelvärde - 2,5 * standardavvikelsen). Dessa brunnar innehåller en potentiell synergist liten molekyl.
    6. Validera skärmen träffar med de metoder som beskrivs i steg 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Schackrutiga analyser finns en semikvantitativ metod för att mäta synergistisk interaktion. Slutresultatet utgång, FICI, avgör om en drog kombination anses synergistisk (FICI ≤0, 5), icke-interagera (0,5 < FICI < 4), eller antagonistiska (FICI ≥4.0). Figur 1 illustrerar hur du ställer in de drogen lutningarna i en schackrutiga assay. Figur 2 illustrerar gemensamma resultat. Tänk tillväxt (lila brunnar) som visar mindre än 90% tillväxthämning. Efter mätning OD600 i varje brunn i en tallrik, normalisera vi allt till kontrollen ingen drog väl. Något med ett normaliserat värde > 0,1 (10% av OD600 i kontrollen väl) görs som ”tillväxt”. FICI noter kan variera beroende på vilket väl plockas; Vi väljer den brunn som ger den lägsta FICI för varje platta. I figur 2A, det vore väl F9 (kolumnerna är numrerade rader bokstäverna), = med en FICI 0,07. I figur 2B, beräknas FICI från väl C3 (FICI = 1,0). För antagonistiska interaktioner, leta efter högsta FICI möjliga poäng. I figur 2 cberäknas FICI från väl A1, som ger en FICI på 8,0.

Optimal screening villkor förhindrar att ett stort antal falsklarm från skärmen, vilket sparar tid och pengar. När vi optimerat synergy förutsägelse mutanter för svampen Cryptococcus neoformans, testade vi ingående drogen (flukonazol), fyra kända icke-synergistisk läkemedel (koffein, climbazole, trimetoprim och brefeldin A) och fem av flukonazols samverkande parter (rifamycin, myriocin, nigericin, rapamycin och FK506, alla diskuteras i Chandrasekaran, S. et al. 18). eftersom vi upptäckte dessa molekyler genom O2M analys (avsnitt 1 och 2), vi förväntade oss de kända synergizers att selektivt hämma tillväxten av synergy förutsägelse mutanta celler men inte vildtyps-celler. För att maximera den förväntade tillväxt skillnaden, testade vi en serie koncentrationer för varje liten molekyl, varav de flesta var sub-hämmande.

Exempel på resultat visas i figur 3. En molekyl som inte agerar synergistiskt med flukonazol, brefeldin A, hämmad vildtyp och synergy förutsägelse mutant tillväxt endast något, och ungefär lika många. Rifamycin (figur 3B), tillväxt av synergy förutsägelse mutant (cnag_03917Δ) hämmades, men vildtyp celltillväxt var inte. Den största tillväxt skillnaden var mellan 32 och 49 h efter inympningen, så tidpunkt för screening var i detta intervall. Tillväxtkurvor av andra samverkande och icke-synergistisk molekylerna liknade de rifamycin och brefeldin A, respektive.

Figure 1
Figur 1 : Skildring av schackrutiga analys från steg 3. Testet drog- och input drog Övertoningarna illustreras i A och B, respektive. Den slutliga analys plattan bör visas som C. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Grafisk resultaten av schackrutiga Assay. Illustrationer av synergistisk, ingen, och antagonistiska interaktioner skildras i A, B och C, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Exempeldata för att identifiera screening tid. (A) Wild-type (grön) och synergy förutsägelse mutant (blå) av C. neoformans vuxit i närvaro av en brefeldin A, en liten molekyl som är kända att inte samverka med flukonazol. Vildtyp kontroll (Mörkgrön) och drog behandlas (ljusgrön) har en liknande skillnad i tillväxt synergy förutsägelse mutant kontroll (mörkblå) och drog behandlas (ljusblå). (B) Wild-type och synergy förutsägelse mutant vuxit i närvaro av rifamycin, en liten molekyl som är kända att samverka med flukonazol. Vildtyp kontroll (Mörkgrön) och drog behandlas (ljusgrön) har en mindre tillväxt skillnad än synergy förutsägelse mutant kontroll (mörkblå) och drog behandlas (ljusblå). Den största skillnaden observeras på 48 h för kända synergistiska molekyl och skillnaden är liknande som tidpunkt för kända icke-synergistisk molekyl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Synergistisk småmolekylära par kan vara ett kraftfullt verktyg för att behandla mikrobiella infektioner, men de har inte nått sin full klinisk potential eftersom synergistisk par är utmanande att identifiera. Detta dokument beskriver en metod för att identifiera synergistisk par mycket snabbare än enkla parvisa kombinationer. Genom att använda kemisk-genetik datamängder, identifierar O2M mutanter med gen knockouts som kan sedan användas som en avläsning till skärmen stora bibliotek med små molekyler för att förutsäga synergistisk par. Förmågan att förutse små molekyler möjliggör hög skalbarhet av skärmar, vilket i sin tur gör för storskalig identifiering av samverkande partner. Efter att identifiera synergistisk par, kan en klarlägga de molekylära mekanism underliggande synergistiska interaktionerna, sedan rationellt designa ytterligare synergistisk par11.

O2M kräver en kemisk-genetiska datamängd och en kända synergistiska par. Lyckligtvis, kemisk-genetik datamängder är gemensamma för en mängd mikrober19,20,21. Brun labbet har tidigare visat att O2M framgångsrikt kan hitta synergistisk par i både C. neoformans och E. coli11,12. Detta visar att den brett genomslag O2M har som en skalbar metod som är allmänt tillämplig på en mängd organismer. Alla åtgärder som anges här kan ändras för tillväxten av en annan mikroorganism med relativt liknande resultat, vilket gör O2M ett värdefullt verktyg för generell identifiering av synergistisk par. Flera andra grupper är att identifiera synergistiska kombinationer från kemikalie-genetik datamängder genom olika analysmetoder, även om O2M kräver minst programmering kunskap om någon av dessa metoder. Varje metod identifierar olika uppsättningar av synergistisk antibiotika eller antimykotika 18,22,23,24, vilket tyder på att ett stort antal samverkande par återstår upptäckas. O2M och andra synergy beräkningsmetoder är också potentiellt tillämpliga på däggdjur system, inklusive att identifiera cancer läkemedelskombinationer.

Sammanfattningsvis beskriver denna metod ett snabbt sätt att skärmen för synergistisk par från en kemikalie-genetik-datamängd. Denna metod och andra hjälpa synergistisk par blivit en mer genomförbart behandlingsalternativ på kliniker. Dessutom bevisar O2M's snabb och generaliserad metod det ett värdefullt verktyg när de söker sig synergistisk småmolekylära par.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av en start bidrag från Institutionen för patologi, University of Utah till J.C.S.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioscreen C instrument Growth Curves USA
Synergy H1 instrument BioTek
M9 broth reagent Amresco J863-500G
Casamino Acids reagent Fisher Scientific BP1424-500
Glucose reagent Sigma G7021-10KG
Nicotinic Acid reagent Alfa Aesar A12683
Thiamine reagent Acros Organics 148991000
CaCl2 Dihydrate reagent Fisher C79-500
MgSO4 Heptahydrate reagent Fisher M63-500
chemical-genetics dataset dataset examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.
trimethoprim (example input drug; any can be used) reagent Fisher Scientific ICN19552701
sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) reagent Fisher Scientific ICN15671125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
  2. Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
  3. Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
  4. Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
  5. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
  6. Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
  7. Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
  8. Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
  9. Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
  10. Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
  11. Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
  12. Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
  13. Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
  14. Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
  15. Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
  16. Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
  17. Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
  18. Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
  19. Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
  20. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
  21. Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
  22. Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
  23. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
  24. Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).

Tags

Genetik fråga 135 antibiotikaresistens antibiotikaresistens läkemedelskombinationer drog synergy hög genomströmning skärm överlappning2 Metod
Hög genomströmning identifiering av synergistisk läkemedelskombinationer med överlappning<sup>2</sup> Metod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wambaugh, M. A., Brown, J. C. S.… More

Wambaugh, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method. J. Vis. Exp. (135), e57241, doi:10.3791/57241 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter