High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode
Summary
Synergetische drug combinaties zijn moeilijk en tijdrovend te identificeren empirisch. Hier beschrijven we een methode voor het vaststellen en valideren van synergetische kleine moleculen.
Abstract
Hoewel antimicrobiële geneesmiddelen dramatisch de levensduur en de kwaliteit van leven in de 20ste eeuw toegenomen zijn, dreigt antimicrobiële resistentie onze hele samenleving vermogen om systemische infecties te behandelen. In de Verenigde Staten alleen al doden antibiotica-resistente infecties ongeveer 23.000 mensen per jaar en de kosten ongeveer 20 miljard USD in de aanvullende gezondheidszorg. Een aanpak ter bestrijding van antimicrobiële resistentie is combinatietherapie, die vooral handig in de kritische vroeg stadium van de infectie, is voordat het infecteren organisme en haar weerstandsprofiel drug zijn geïdentificeerd. Vele antimicrobiële behandelingen gebruiken combinatie therapieën. Echter, de meeste van deze combinaties zijn additief, wat betekent dat de gecombineerde doeltreffendheid hetzelfde als de som van de individuele antibiotica werkzaamheid is. Sommige combinatie therapieën zijn synergetische: de gecombineerde doeltreffendheid is veel groter dan additief. Synergetische combinaties zijn bijzonder nuttig, omdat ze de groei van antimicrobiële drug resistente stammen remmen kunnen. Deze combinaties zijn echter zeldzaam en moeilijk te identificeren. Dit is te wijten aan het grote aantal moleculen moest worden getest in een paarsgewijze wijze: een bibliotheek met 1000 moleculen heeft 1 miljoen mogelijke combinaties. Dus, hebben inspanningen geleverd om te voorspellen van moleculen voor de synergie. Dit artikel beschrijft onze high-throughput methode voor het voorspellen van synergetische klein molecuul paren bekend als de overlapping2 methode (O2M). O2M maakt gebruik van patronen van chemische-genetische datasets te identificeren van mutanten die overgevoelig zijn voor elke molecuul in een synergetische paar maar niet voor andere moleculen. De bruine lab exploiteert dit verschil groei door het uitvoeren van een high-throughput scherm voor moleculen die de groei van mutant maar niet wild-type cellen remt. De lab werk eerder aangeduid moleculen die synergize met de antibiotica trimethoprim en de antischimmel drug fluconazol met behulp van deze strategie. Hier, presenteren de auteurs een methode om scherm voor roman synergetische combinaties, die voor meerdere micro-organismen kan worden gewijzigd.
Introduction
Antibiotica-resistente bacteriën veroorzaken meer dan 2 miljoen infecties en 23.000 sterfgevallen per jaar in de Verenigde Staten volgens de CDC-1. Nieuwe behandelingen zijn nodig om deze infecties te overwinnen. Strategieën om te identificeren deze nieuwe behandelingen omvatten de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële geneesmiddelen of de herbestemming van kleine moleculen goedgekeurd voor andere voorwaarden voor het behandelen van microbiële infecties2,3,4. Nieuwe drugontdekking is echter zeer duur en tijdrovend. Herbestemming van drugs kan niet identificeren nieuwe medicijnen of drugs richt zich op5,6. Onze lab richt zich op een derde strategie synergetische combinatie therapie genoemd. Synergetische combinaties optreden wanneer twee kleine moleculen samen een werkzaamheid die groter is dan het additieve effect van hun individuele efficacies7. Bovendien, kunnen synergetische combinaties effectief tegen een aan één van de kleine moleculen in het paar naast het hebben van minder ongewenste effecten van de af-target, waardoor ze grote potentiële8,9, resistente pathogenen 10.
Synergetische paren zijn zeldzaam, die zich in ongeveer 4-10% van de drug combinaties11,12,13. Dus zijn traditionele technieken zoals paarsgewijze schermen uitdagende en tijdrovend, met duizenden mogelijke combinaties van een kleine bibliotheek van honderd moleculen. Bovendien, synergetische interactie meestal niet kan worden voorspeld uit de activiteit van de verbindingen14. Echter, de auteurs een benadering van de hoge gegevensdoorvoer aan het scherm voor synergetische paren, genaamd de overlapping2 methode (O2M)12ontwikkeld. Deze methode wordt hier beschreven, zorgt voor snellere en efficiëntere identificatie van deze synergetische paren. O2M vereist het gebruik van een bekende synergetische pair en een chemische-genetica dataset. Chemische-genetica datasets worden gegenereerd wanneer een bibliotheek van knock-out mutanten wordt geteeld in de aanwezigheid van veel verschillende kleine moleculen. Als één molecule in een bekende synergetische paar het hetzelfde fenotype van een mutant bepaalde knock-out als de tweede synergetische molecuul induceert, moet andere klein molecuul dat het fenotype van dat dezelfde mutant lokt ook met elk lid van de bekende synergize synergetische paar. Deze motivering is gebruikt in de bruine lab te identificeren synergetische antibiotica paren actief tegen Escherichia coli (E. coli) en synergetische antischimmel drug paren actief tegen de pathogene schimmel Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M is niet alleen geschikt voor verschillende ziekteverwekkers, maar zorgt voor de screening van grote bibliotheken van moleculen te identificeren synergetische paren gemakkelijk en snel. Screening met de genetische mutant geïdentificeerd door O2M laat ons toe om alleen die kleine moleculen voorspeld voor synergie te valideren. Dus, een 2.000-molecuul bibliotheek pairwise testing maanden zou duren, overwegende dat mochten er slechts 20 moleculen in die bibliotheek voorspeld synergize, testen voor synergie nu een kwestie van dagen neemt. O2M vereist geen programmering vaardigheden, en de benodigde apparatuur is beschikbaar in de meeste laboratoria of core faciliteiten. Naast de onderzoekers ook geïnteresseerd in de drug combinaties is O2M analyse van belang voor iedereen die een drug-scherm heeft afgerond en wil hun hits uit te breiden door het identificeren van belangrijke drug-drug-interacties. Hieronder is het protocol voor het identificeren van synergetische kleine molecules in bacteriën, evenals het valideren van de voorspelde synergetische interacties in bekende assays15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synergetische klein molecuul paren kunnen een krachtig instrument in de behandeling van infecties die micro-organismen, maar ze hebben niet hun volledige klinische potentieel bereikt omdat synergetische paren zijn uitdagend om te identificeren. Dit document wordt een methode voor het identificeren van synergetische paren veel sneller dan eenvoudige paarsgewijze combinaties beschreven. Met behulp van chemische-genetica datasets, identificeert O2M mutanten met gene uitsparingen die vervolgens kunnen worden gebruikt als een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het opstarten van de afdeling Pathologie, Universiteit van Utah naar J.C.S.B.
Materials
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -. Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
