Høj overførselshastighed identifikation af synergistiske Drug kombinationer af overlapning2 metode
Summary
Synergistisk drug kombinationer er vanskeligt og tidskrævende at identificere empirisk. Her, beskriver vi en metode til at identificere og validere synergistiske små molekyler.
Abstract
Selv om antimikrobielle stoffer steget dramatisk levetid og livskvalitet i det 20. århundrede, truer antimikrobiel resistens vores hele samfundets evne til at behandle systemiske infektioner. I USA alene dræbe antibiotika-resistente infektioner cirka 23.000 personer om året og omkostninger omkring 20 milliarder amerikanske dollars i ekstra sundhedspleje. En metode til bekæmpelse af antimikrobiel resistens er kombinationsbehandling, som er særligt nyttigt i den kritiske tidlige fase af infektion, før de inficerer organisme og dens drug modstand profil er blevet identificeret. Mange antimikrobiel behandlinger bruge Kombinationsbehandlinger. Men de fleste af disse kombinationer er additive, hvilket betyder, at den kombinerede effekt er den samme som summen af de individuelle antibiotisk virkning. Nogle Kombinationsbehandlinger er synergistisk: kombineret effekten er langt større end additiv. Synergistisk kombinationer er især nyttige, fordi de kan hæmme væksten af antimikrobielt resistente stammer. Men disse kombinationer er sjældne og svære at identificere. Dette er på grund af det store antal af molekyler skulle være testet i en parvis måde: et bibliotek af 1.000 molekyler har 1 millioner potentielle kombinationer. Således har gjort en indsats for at forudsige molekyler for synergi. Denne artikel beskriver vores høj overførselshastighed metode til at forudsige synergistiske lille molekyle par kendt som overlapning2 metode (O2M). O2M bruger mønstre fra kemiske-genetiske datasæt til at identificere mutanter, der er overfølsomme for hvert molekyle i en synergistisk par, men ikke til andre molekyler. Den brune lab udnytter denne vækst forskel ved at udføre en høj overførselshastighed skærm for molekyler, der hæmmer væksten af mutant men ikke wild-type celler. Lab’s arbejde tidligere identificerede molekyler, der synergieffekter med de antibiotiske trimethoprim og svampedræbende stof fluconazol ved hjælp af denne strategi. Forfatterne præsenterer her, en metode til skærmen for romanen synergistiske kombinationer, der kan ændres til flere mikroorganismer.
Introduction
Antibiotikaresistente bakterier forårsager mere end 2 millioner infektioner og 23.000 dødsfald årligt i USA Ifølge CDC1. Nye behandlinger er nødvendig for at overvinde disse infektioner. Strategier til at identificere disse nye behandlinger omfatter udvikling af nye antimikrobielle stoffer eller nyorientering af små molekyler godkendt til andre betingelser til behandling af mikrobielle infektioner2,3,4. Nye drug discovery er dog meget dyrt og tidskrævende. Nyorientering narkotika kan ikke identificere roman medicin eller narkotika mål5,6. Vores lab fokuserer på en tredje strategi er kendt som synergistisk Kombinationsbehandlinger. Synergistisk kombinationer opstår når to små molekyler sammen har en effekt, der er større end den additive effekt af deres individuelle efficacies7. Derudover kan synergistiske kombinationer være effektiv mod en patogen resistente over for en af de små molekyler i parret ud over at have mindre uønskede off target effekter, gør dem store potentielle8,9, 10.
Synergistisk par er sjælden, forekommer i ca. 4-10% af stoffet kombinationer11,12,13. Således er traditionelle teknikker såsom parvise skærme udfordrende og tidskrævende, med tusindvis af potentielle kombinationer fra et lille bibliotek af hundrede molekyler. Derudover synergistiske interaktioner normalt kan ikke forudsiges fra aktiviteten af forbindelser14. Men forfatterne udviklet en høj overførselshastighed tilgang til at screene for synergistiske par, kaldet overlapning2 metode (O2M)12. Denne metode, beskrevet her, giver mulighed for hurtigere, mere effektiv identifikation af disse synergistiske par. O2M kræver brug af en kendt synergistiske par og et kemikalie-genetik datasæt. Kemikalie-genetik datasæt genereres, når et bibliotek af knockout mutanter er vokset i overværelse af mange forskellige små molekyler. Hvis et molekyle i en kendt synergistiske par inducerer samme fænotype fra en bestemt knockout mutant som den anden synergistiske molekyle, bør andre lille molekyle, der fremkalder fænotype fra den samme mutant også synergieffekter med hvert medlem af kendt synergistisk par. Denne logik har været brugt i brun lab til at identificere synergistiske antibiotika par aktive mod Escherichia coli (E. coli) og synergistiske svampedræbende stof par aktive mod patogene svampen Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M er ikke kun kan tilpasses til forskellige patogener, men giver mulighed for screening af store biblioteker af molekyler til at identificere synergistiske par nemt og hurtigt. Screening med den genetiske mutant identificeret ved O2M tillader os at validere kun de små molekyler forudsagt for synergi. Således ville test en 2.000-molekyle bibliotek parvis tage måneder, hvis der var kun 20 molekyler i biblioteket forudsagt for at synergieffekter, test for synergy nu tager et spørgsmål om dage. O2M kræver ingen programmering færdigheder, og det nødvendige udstyr er tilgængelig i de fleste labs eller core faciliteter. Ud over forskere interesseret i stof kombinationer er O2M analyse af interesse for alle, der har gennemført et stof skærmen og ønsker at udvide deres hits ved at identificere vigtige stof-drug interaktioner. Herunder er protokol for at identificere synergistiske små molekyler i bakterier, samt validering af de forudsagte synergistiske interaktioner i velkendte assays15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synergistisk lille molekyle par kan være et effektivt redskab til behandling af mikrobielle infektioner, men de har ikke nået deres fulde kliniske potentiale fordi synergistiske par er udfordrende at identificere. Dette papir beskriver en metode til at identificere synergistiske par meget hurtigere end simpel parvise kombinationer. Ved hjælp af kemisk-genetik datasæt, identificerer O2M mutanter med gen knockouts, som derefter kan bruges som en udlæsning på skærmen store biblioteker af små molekyler for at forudsi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en start tilskud fra Institut patologi, University of Utah til J.C.S.B.
Materials
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -. Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
