Høy gjennomstrømming identifikasjon av synergistisk rusmiddelkombinasjoner av overlapping2 metoden
Summary
Synergistisk rusmiddelkombinasjoner er vanskelig og tidkrevende å identifisere empirisk. Her beskriver vi en metode for å identifisere og validere synergistisk små molekyler.
Abstract
Selv om antimikrobielle narkotika har dramatisk økt levetid og livskvalitet i20 århundre , truer resistensutvikling vår hele samfunnets evne til å behandle systemisk infeksjoner. I USA alene drepe antibiotika-resistente infeksjoner ca 23 000 ansatte et år og koster rundt 20 milliarder USD i flere helsevesenet. En tilnærming til å bekjempe resistensutvikling er Kombinasjonsbehandling, som er spesielt nyttig i kritiske tidlig stadium av infeksjon, før infisere organismen og sine narkotika motstand profil har blitt identifisert. Mange antimikrobielle behandlinger bruke kombinasjonen terapier. Men de fleste av disse kombinasjonene er additiv, betyr at den kombinerte effekten er den samme som summen av enkelte antibiotika effekten. Noen kombinasjon terapi er gjensidig forsterkende: kombinerte effekten er mye større enn additiv. Synergistisk kombinasjoner er spesielt nyttige fordi de kan hemme veksten av antimikrobielle-resistente bakteriestammer. Men er disse kombinasjonene å identifisere. Dette er på grunn av det store antallet molekyler måtte bli testet på en parvis måte: et bibliotek av 1000 molekyler har 1 millioner mulige kombinasjoner. Dermed har innsats blitt gjort å forutsi molekyler for synergi. Denne artikkelen beskriver vår høy gjennomstrømming metode for å forutsi synergistisk små molekyl par kjent som overlapper2 metoden (O2M). O2M bruker mønstre fra kjemisk-genetiske datasett for å identifisere mutanter som er overfølsom til hvert molekyl i en synergistisk par men ikke til andre molekyler. Brun laboratoriet utnytter denne veksten forskjellen ved å utføre en høy gjennomstrømming skjerm for molekyler som hemmer veksten av mutant men ikke vill-type celler. Lab arbeidet tidligere identifisert molekyler som synergize med antibiotika trimethoprim og soppdrepende narkotikabruk fluconazole bruker denne strategien. Her, presenterer forfatterne en metode til skjermen for romanen synergistisk kombinasjoner, som kan endres for flere mikroorganismer.
Introduction
Antibiotika-resistente bakterier forårsaker mer enn 2 millioner infeksjoner og 23 000 dødsfall årlig i USA i henhold til CDC1. Nye behandlinger for å overvinne disse infeksjonene. Strategier for å identifisere disse nye behandlinger inkluderer utvikling av nye antimikrobielle stoffer eller gjenbruk av små molekyler godkjent for andre betingelser for å behandle mikrobielle infeksjoner2,3,4. Men er nye stoffet funnet svært kostbare og tidkrevende. Gjenbruk narkotika kan ikke identifisere romanen narkotika eller narkotika mål5,6. Våre lab fokuserer på en tredje strategi kjent som synergistisk kombinasjon terapier. Synergistisk kombinasjoner oppstår når to små molekyler sammen har en effekt som er større enn den additiv effekten av deres personlige efficacies7. I tillegg kan synergistisk kombinasjoner være effektiv mot en patogen motstandsdyktig mot en av de små molekylene i paret i tillegg til mindre uønskede off-målet effekter, gjør dem stor potensiell8,9, 10.
Synergistisk par er sjeldne, forekommer i ca 4-10% av narkotika kombinasjoner11,12,13. Dermed er tradisjonelle teknikker som parvis skjermer utfordrende og tidkrevende, med tusenvis av mulige kombinasjoner fra et lite bibliotek av hundre molekyler. Videre kan synergistisk interaksjoner vanligvis ikke forutses fra aktiviteten av forbindelser14. Imidlertid utviklet forfatterne en høy gjennomstrømming tilnærming til skjermen for synergistiske par, kalt overlapping2 metoden (O2M)12. Denne metoden beskrevet her, gir raskere, mer effektiv identifikasjon av disse synergistisk parene. O2M krever bruk av en kjent synergistisk par og kjemisk-genetikk dataset. Kjemisk-genetikk datasett genereres når et bibliotek med knockout mutanter er dyrket i nærvær av mange forskjellige små molekyler. Hvis ett molekyl i et kjent synergistisk par induserer samme fenotypen fra en bestemt knockout mutant som andre synergistisk molekylet, bør noen andre små molekyl som utløser fenotypen fra som samme mutant også synergize med hvert medlem av kjente synergistisk par. Denne begrunnelsen er brukt i brun lab for å identifisere synergistisk antibiotika par aktiv mot Escherichia coli (E. coli) og synergistiske soppdrepende narkotika par aktiv mot sykdomsfremkallende soppen Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M er ikke bare tilpasses ulike patogener, men gir screening av store biblioteker av molekyler å identifisere synergistisk par enkelt og raskt. Screening med genetisk mutant identifisert av O2M tillater oss å validere bare disse små molekyler forutsett synergi. Dermed ville testing et 2000-molekylet bibliotek parvis ta måneder, mens hvis det var bare 20 molekyler i biblioteket spådd for å synergize, tester for synergi nå tar dager. O2M krever ikke programmeringskunnskaper, og de nødvendige utstyret er tilgjengelig i de fleste labs eller core fasiliteter. Forskere interessert i rusmiddelkombinasjoner er O2M analyse av interesse for alle som har fullført en narkotika-skjerm og ønsker å utvide deres treff ved å identifisere viktige narkotika-interaksjoner. Nedenfor er protokollen for identifisere synergistisk små molekyler i bakterier, i tillegg til å validere spådd synergistisk samhandlinger i kjente analyser15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synergistisk små molekyl parene kan være et kraftig verktøy i behandling av mikrobielle infeksjoner, men de har ikke nådd full kliniske potensialet fordi synergistisk par utfordrende å identifisere. Denne artikkelen beskriver en metode for å identifisere synergistisk par mye raskere enn enkel parvis kombinasjoner. Ved å bruke kjemiske-genetikk datasett, identifiserer O2M mutanter med gene fortrenging som kan brukes som en presentasjon til skjermen store biblioteker av små molekyler slik synergistisk par. Mulighet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en oppstart stipend fra avdeling for patologi, Universitetet i Utah til J.C.S.B.
Materials
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -. Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
