यहां, हम स्वयं में 3d संस्कृति प्रणालियों-कोडांतरण पेप्टाइड पाड़ों को उपास्थि की तरह ऊतक में विभेदित मानव जोड़दार chondrocytes के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
एक स्व-कोडांतरण nanofiber तीन आयामी (3 डी) पाड़ में संवर्धन कोशिकाओं के लिए एक उपयोगी तकनीक का वर्णन किया गया है । इस संस्कृति प्रणाली को बारीकी से गैर-ध्रुवीय ऊतक के संरचनात्मक सुविधाओं की नकल है कि एक वातावरण recreates । इसके अलावा, पाड़ के विशेष आंतरिक nanofiber संरचना यह दृश्य प्रकाश, जो माइक्रोस्कोपी के तहत नमूना के आसान दृश्य के लिए अनुमति देता है के लिए पारदर्शी बनाता है । यह लाभ काफी हद तक सेल प्रवास, संगठन, प्रसार, और भेदभाव और इस प्रकार विशिष्ट रंजक या जांच के साथ धुंधला द्वारा अपने विशेष सेलुलर समारोह के किसी भी विकास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके अलावा, इस काम में, हम इस प्रणाली के अच्छे प्रदर्शन का वर्णन करने के लिए आसानी से उपास्थि ऊतक में विस्तारित मानव जोड़दार chondrocytes के अंतर का अध्ययन । कोशिकाओं को आत्म में समझाया पेप्टाइड पाड़ों कोडांतरण और विशिष्ट परिस्थितियों में chondrogenesis को बढ़ावा देने के लिए किया गया । तीन आयामी संस्कृतियों प्रयोग के 4 हफ्तों के दौरान अच्छी व्यवहार्यता दिखाया । के रूप में की उंमीद है, नमूनों chondrogenic उत्प्रेरण के साथ प्रसंस्कृत (गैर प्रेरित नियंत्रण की तुलना में) toluidine नीले रंग के लिए जोरदार सकारात्मक दाग (जो दाग glycosaminoglycans (परिहास) कि अत्यधिक उपास्थि extracellular मैट्रिक्स में मौजूद हैं) और व्यक्त विशेष आणविक मार्करों, कोलेजन प्रकार मैं, द्वितीय और एक्स सहित, पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण के अनुसार । इस प्रोटोकॉल के लिए प्रदर्शन आसान है और अनुसंधान प्रयोगशालाओं, उद्योगों में और प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में शैक्षिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कई दशकों के लिए, स्तनधारी सेल संस्कृति प्रयोगात्मक शर्तों के तहत किया गया है शास्त्रीय दो आयामी (2d) संस्कृति व्यावहारिक और आर्थिक मुद्दों के कारण गैर शारीरिक पहलुओं की परवाह किए बिना का उपयोग कर । हालांकि इस संस्कृति प्रणाली के अध्ययन और सबसे आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने में मदद करता है, हम आज पता है कि नए सेल संस्कृति मानदंड को और अधिक जटिल सेलुलर सिस्टम का अध्ययन करने की जरूरत है । इसलिए, तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों के लिए एक microenvironment है कि शारीरिक रूप से, यांत्रिक और जैविक रूप से अधिक प्राकृतिक ऊतकों के समान है बहलाना की जरूरत है । हाल के वर्षों में, 3 डी संस्कृति प्रणालियों, सामांय में, शोधकर्ताओं और उद्योग के बीच अधिक प्रचलित हो गए है क्योंकि वे अध्ययन या स्क्रीनिंग जो कोशिकाओं में अंतरिक्ष में वृद्धि कर सकते है के एक नए मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, सेल बनाने के लिए सेल या सेल करने वाली मैट्रिक्स बातचीत, पलायन और अंत में विशिष्ट कोशिका वंश में अंतर ।
इस पद्धति का समग्र लक्ष्य एक इन विट्रो सेलुलर microenvironment है कि vivo microenvironment में के करीब है बहलाना है । विशेष रूप से, सिंथेटिक स्वयं कोडांतरण पेप्टाइड पाड़ (SAPS) अद्वितीय गुणों के साथ एक प्रकार का पदार्थ है; यह नैनोमीटर के एक नेटवर्क रूपों-यांत्रिक और संरचनात्मक गुणों के साथ पेप्टाइड्स के बीच कमजोर बातचीत से बाहर कर दिया pores आकार प्राकृतिक extracellular मैट्रिक्स के समान । दूसरे शब्दों में, इस सामग्री के उपयोग के पीछे तर्क यह है कि यह वास्तव में एक 3 डी वातावरण है कि छद्म 3 डी ऊतकों या अंग इकाइयों को प्राप्त करने के लिए आदर्श है बनाता है । हालांकि, सबसे महत्वपूर्ण बात, 3 डी संदर्भ 3 डी संरचना नए जैविक कार्य है कि सामांय रूप से 2d संस्कृति प्लेटफार्मों में मौजूद नहीं है लाभ के लिए अनुमति देता है, जैसे ऊतक वास्तुकला से संबंधित गुण, बड़े पैमाने पर स्थानांतरण घटनाएं, सेल स्वरूप और अंततः ऊतक morphogenesis, जो भविष्य के अनुसंधान और कार्यात्मक ऊतकों और अंगों के विकास में महत्वपूर्ण कारक हैं1,2. इसके अलावा, अपने प्राकृतिक समकक्षों (कोलेजन, Matrigel) पर SAPS का एक फायदा यह है कि वे कमरे के तापमान पर बहुत स्थिर है और पद के लिए विशेष शर्तों की आवश्यकता नहीं है उत्पादन, वितरण या3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS को संभालना आसान है, जब वांछित; 3 डी जैल बस ईओण ताकत में वृद्धि या तटस्थता1,2के लिए पीएच समायोजन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । अंत में, यहां वर्णित पद्धति बड़े पैमाने पर इन विट्रो में इस्तेमाल किया गया है रखरखाव, विकास को बढ़ावा देने के लिए, और chondrocytes, हेपैटोसाइट्स, endothelial कोशिकाओं, osteoblasts, न्यूरॉन कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से सहित सेल प्रकार की एक संख्या के भेदभाव, भ्रूण और दैहिक स्टेम कोशिकाओं के रूप में3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. वर्तमान कार्य में, हम मानव विस्तारित जोड़दार chondrocytes (hACh) को उपास्थि की तरह ऊतक में अंतर करने के लिए 3d संस्कृति प्रणाली के उपयोग का वर्णन पहले11वर्णित के रूप में करते हैं ।
यहाँ, SAPS का उपयोग कर एक 3d सिस्टम में संस्कृति कोशिकाओं के लिए एक विधि वर्णित है. इस सिंथेटिक सामग्री में, कोशिकाओं को पहले एक पेप्टाइड समाधान के साथ मिश्रित कर रहे हैं, जो बाद में स्वयं को प्रेरित है इकट्ठा, कोशिकाओं के आसपास nanometric आयामों का एक नेटवर्क बनाने और इसलिए वास्तव में एक 3 डी वातावरण बनाने (चित्रा 1) । यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि सेलुलर व्यवहार मैट्रिक्स कठोरता मूल्यों (यानी, प्रसार, प्रवास और भेदभाव) से प्रभावित है । इसलिए, एक आम methodological नियंत्रण एक ही कठोरता मूल्यों (संस्कृति दो आयामों पर) के साथ पेप्टाइड पाड़ के शीर्ष पर संस्कृति कोशिकाओं के लिए है ।
पहले, हमारे समूह और दूसरों को विविध सेल सिस्टम3,4,5,6,7,8 के साथ तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्लेटफार्मों के उपयोग का वर्णन किया है ,9,10,11,12,13,14,15। वर्तमान काम में, हम 3d कल्चर सिस्टम प्राप्त करने की एक आसान और विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं जो किसी भी प्रकार के कार्यात्मक कोशिका, भ्रूण या वयस्क स्टेम कोशिकाओं, या अंततः, बेकार कोशिकाओं से पृथक सहित स्तनधारी कोशिकाओं के लिए लागू होते हैं बायोप्सी या ट्यूमर, और इतने पर। इसके अलावा, स्वतंत्र रूप से, यदि स्टेम सेल भ्रूण या वयस्क मूल के है वे 3 डी वातावरण में एक बेहतर वंश प्रतिबद्धता की क्षमता की तुलना में शास्त्रीय 2d संस्कृति व्यंजन10,11,12, 13,14,15. इसलिए, इस प्रणाली में कोशिका संस्कृति कार्यात्मक ऊतक में भेदभाव के लिए नेतृत्व की तरह संरचनाओं कि विभिंन अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिकारक या reअपक्षय से विषाक्तता और औषधीय प्लेटफार्मों के लिए है ।
हम सेल समारोह में एक स्पष्ट लाभ पता चला है क्योंकि सेलुलर microenvironment मैट्रिक्स संरचना और जैव यांत्रिक, भौतिक और जैविक मापदंडों के संदर्भ में प्राकृतिक ऊतकों के समान है । फिर भी, के रूप में प्रणाली और अधिक जटिल हो जाता है, मानकों की जरूरत है कि विनियमित किया जा करने की आवश्यकता है, जो एक बाहरी समर्थन मंच (जैसे कि एक सक्रिय छिड़काव प्रणाली जन स्थानांतरण घटना से बचने के लिए-जुड़े मुद्दों के रूप में शामिल है की जरूरत है ). तीन-आयामी प्रसंस्कृत कोशिकाएँ आवश्यक गतिविधियों को विनियमित करने के मामले में बेहतर प्रदर्शन करती हैं, जैसे कि प्रवास, प्रसार और विभेद. वे जटिल सेलुलर crosstalk, जो अब तक बढ़ रहा है और 3 डी में अंतर का एक अनिवार्य परिणाम है अनुमति नेटवर्क फार्म सकता है । तथ्य यह है कि SAPS उन extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के समान इन विट्रो में शर्तों बना सकता है एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है प्रत्येक घटक के लिए उत्पादित प्रभाव का एक तर्कसंगत अध्ययन के बाद से पाड़ (विकास फैक्टर, polysaccharide या संकेतन करने के लिए जोड़ा पेप्टाइड) आसानी से किया जा सकता है ।
इस तरह के कोलेजन प्रकार मैं और Matrigel के रूप में अंय प्राकृतिक पाड़, की तुलना में SAPS के उपयोग के स्पष्ट लाभ, निंनलिखित हैं: 1) SAPS बैच उत्पादन के लिए बैच से ंयूनतम परिवर्तन के साथ एक सिंथेटिक सामग्री है; 2) SAPS विशिष्ट पेप्टाइड रूपांकनों के साथ कार्यात्मक होने की क्षमता है; और 3) SAPS इन विट्रो मेंकम biodegradability प्रस्तुत करता है, जो 3d के रखरखाव को समय के साथ ही, भौतिक, यांत्रिक और संरचनात्मक गुणों से निर्मित करने के लिए परमिट देता है । हालांकि, SAPS बनाम अंय पाड़ों का उपयोग करने की सीमा encapsulation कदम है, जहां कोशिकाओं को एक शत्रुतापूर्ण कम पीएच के कारण वातावरण में है के दौरान पाया जाता है । इसलिए, यह वर्णित पद्धति में एक महत्वपूर्ण कदम है । इसके अलावा, यह किसी भी प्रयोग शुरू करने से पहले प्रत्येक विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए SAPS एकाग्रता सेट करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह है, वास्तव में, आवश्यक है जब कोशिकाओं पर या इन में, एक विशेष रूप से सेल प्रकार इष्टतम यांत्रिक विकास की स्थिति पेश करेंगे इन भौतिक भौतिकवाद में, संस्कृति रहे हैं ।
अंत में, हम मानते है कि डिजाइन और इस प्रकार के निर्माण के लिए और अधिक शारीरिक और विश्वसनीय 3d ऊतक मॉडल के विकास को बढ़ाने के लिए दवा उद्योग के लिए बेहतर चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने में मदद करेगा अपक्षय चिकित्सा, कैंसर या किसी भी चिकित्सा उपचार ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों द्वारा की गई अनुसंधान अनुदान समझौते No. २२९२३९ के तहत यूरोपीय संघ सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-२०१३) से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और ए ओ फाउंडेशन, खोजपूर्ण अनुसंधान सहयोगी अनुसंधान कार्यक्रम तीव्र से उपास्थि पुनर्जनन (स्कार्ट) के लिए परियोजना के लिए सक्रिय और Biomimetic पाड़ों के तहत एसीआई (सीआरपी) चोट/
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |