Här presenterar vi ett protokoll för att få 3D-kultur system i självmonterande peptid ställningar att främja differentieringen av dedifferentiated mänskliga artikulära kondrocyter i brosk-liknande vävnad.
En användbar teknik för odling av celler i en egen montering nanofiber tredimensionella (3D) byggnadsställning beskrivs. Denna kultur systemet återskapar en miljö som nära härmar strukturella drag hos icke-polariserat vävnad. Dessutom gör viss inneboende nanofiber struktur ställningen det transparent för visuell ljus, vilket möjliggör enkel visualisering av provet under mikroskopi. Denna fördel användes i stor utsträckning att studera cellmigration, organisation, spridning, och differentiering och därmed all utveckling av deras särskilda cellulär funktion genom färgning med specifika färgämnen eller sonder. Dessutom i detta arbete beskriver vi de goda resultaten av detta system att enkelt studera redifferentiation av utökade mänskliga artikulära kondrocyter in brosk vävnaden. Cellerna var inkapslad i självmonterande peptid ställningar och odlade särskilda villkor att främja kondrogenes. Tredimensionella kulturer visade god lönsamhet under 4 veckor av experimentet. Som förväntat, prover odlade med chondrogenic inducerare (jämfört med icke-inducerad kontroller) färgas starkt positiv för toluidin blå (som fläckar glykosaminoglykaner (GAG) som är mycket närvarande i brosk extracellulär matrix) och uttryckte specifika molekylära markörer, inklusive kollagen typ I, II och X, enligt Western Blot analys. Detta protokoll är lätt att utföra och kan användas vid forskningslaboratorier, industrier och för utbildningsändamål i laboratoriet kurser.
För många årtionden, har däggdjursceller kultur utförts under experimentella förhållanden använder klassiska tvådimensionella (2D) kultur system på grund av praktiska och ekonomiska frågor oavsett de icke-fysiologiska aspekterna. Trots detta kultur-system hjälper till att studera och förstå den molekylära och cellulära mekanismerna, vet vi idag att nya cell kultur paradigm behövs för att studera mer komplexa cellulära system. Därför är tredimensionell (3D) kultur system behövs för att återskapa en närmiljön som är biofysiskt, biomekaniskt och biologiskt mer liknande till det av naturliga vävnader. Under de senaste åren 3D kultur, i allmänhet har blivit vanligare bland forskare och industri eftersom de representerar en ny modell av studie eller screening i vilka celler kan växa i rymden, skapa cell-till-cell eller cell-till-matrix interaktioner, migrera och så småningom differentieras till viss cell härstamningar.
Det övergripande målet med denna metod är att återskapa en in vitro- cellulära närmiljön som är närmare den i vivo mikromiljö. I synnerhet är syntetiska själv montering peptid ställningen (SAPS) en typ av biomaterial med unika egenskaper. Det bildar ett nätverk av nanometer stora porer gjord av svaga interaktioner bland peptider med mekaniska och strukturella egenskaper liknande de av naturliga extracellulära matriser. Med andra ord, rationalitet bakom användningen av detta material är att det skapar en verkligt 3D-miljö som är idealisk för att erhålla pseudo-3D vävnader eller organ enheter. Men viktigast av allt, 3D ramen ger 3D-strukturen att få nya biologiska funktioner som normalt inte finns i 2D kultur-plattformar, såsom egenskaper relaterade till vävnad arkitektur, massöverföring fenomen, cell mallning och så småningom vävnaden morfogenes, vilket är viktiga faktorer i framtida forskning och utveckling av funktionella vävnader och organ1,2. Dessutom är en fördel av SAPS över deras naturliga motsvarigheter (kollagen, Matrigel) att de är mycket stabila i rumstemperatur och kräver inte särskilda villkor för efterproduktion, distribution eller lagring3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS är lätt att hantera, när du önskas; 3D geler kan erhållas helt enkelt genom att öka jonstyrka eller genom att justera pH till neutralitet1,2. Slutligen, den metod som beskrivs här har i stor utsträckning används in vitro- att främja underhåll, tillväxt och differentiering av ett antal celltyper, inklusive hepatocyter, osteoblaster, endotelceller, kondrocyter, neuronala celler samt som embryonala och somatiska stamceller3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. i den nuvarande arbetet, beskriver vi en 3D-kultur systemet att skilja människors utökade artikulära kondrocyter (hACh) i brosk-liknande vävnad som tidigare beskrivits11.
Här beskrivs en metod för att odla celler i en 3D-systemet med enhetlig arealersättning. I detta syntetiskt biomaterial blandas först celler med en peptid-lösning, som därefter framkallas att själv montera, att skapa ett nätverk av nanometriska dimensioner runt celler och därför skapa en verkligt 3D-miljö (figur 1). Det är viktigt att överväga att cellulära beteende påverkas av stelhet matrisvärden (dvs spridning, migration och differentiering). En gemensam metodologiska kontroll är därför att odla celler ovanpå peptid schavotten med samma styvhet värden (kultur i två dimensioner).
Tidigare, vår grupp och andra har beskrivit användning av tredimensionella (3D) kultur plattformar med olika cell system3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. I den nuvarande arbetet, beskriver vi en enkel och tillförlitlig metod för att erhålla 3D kultur system som är tillämpliga på alla typer av däggdjursceller inklusive någon typ av funktionella cell, embryonala eller vuxna stamceller, eller så småningom, dysfunktionella celler isolerade från biopsier eller tumörer och så vidare. Dessutom självständigt, skulle om stamceller är av embryonala eller vuxen ursprung de ha en bättre härstamning engagemang kapacitet i 3D-miljö än i klassiskt 2D kultur rätter10,11,12, 13,14,15. Därför skulle cellkulturen i detta system leda till differentiering i funktionell vävnad-liknande strukturer som skulle kunna användas i olika tillämpningar, från reparativ eller regenerativ biomedicin till toxikologiska och farmakologiska plattformar.
Vi har visat en tydlig vinst i cellens funktion eftersom den cellulära närmiljön är liknande till det av naturliga vävnader avseende matrisstruktur och biomekaniska, biofysiska och biologiska parametrar. Dock som systemet blir mer komplexa, reglerade antalet parametrar som måste vara också ökar, vilket inkluderar behovet av en extern stödjande plattform (t.ex. en aktiv perfusion system att undvika massöverföring fenomen-associerade problem ). Tredimensionellt odlade celler presterar bättre när det gäller reglerar väsentliga aktiviteter, såsom migration, proliferation och differentiering. De kunde bilda komplexa nätverk möjliggör ökad cellulär överhörning, vilket är överlägset en nödvändig följd av växande och differentiera i 3D. Det faktum som SAPS kunde skapa villkor i vitro liknar de extracellulära matrix proteiner utgör en fördel eftersom en rationell studie av effekten produceras för varje komponent till schavotten (tillväxtfaktor, polysackarid eller signalering peptid) kan utföras enkelt.
Tydligt fördelarna med användningen av SAPS jämfört med andra naturliga ställningar, såsom kollagen typ I och Matrigel, är följande: 1) SAPS är ett syntetiskt biomaterial med minimal variation från batch till batch produktion; (2) SAPS har kapacitet att vara functionalized med specifika peptid motiv; och 3) SAPS presenterar låg nedbrytbarhet i vitro, som möjliggör upprätthållandet av den 3D bygga med samma biofysiska, biomekaniska och strukturella egenskaper över tiden. Dock begränsningen av använder SAPS kontra andra ställningar hittar under inkapsling steg, där cellerna i en fientlig miljö på grund av lågt pH. Detta är därför ett viktigt steg i den beskrivna metoden. Dessutom är det viktigt att ange SAPS koncentrationen för varje specifik cell innan du börjar några experiment. Detta är i själva verket viktigt när celler odlas på eller in i dessa biomaterial, eftersom varje typ av viss cell kommer att presentera optimal biomekaniska tillväxt villkorar.
Slutligen anser vi att design och tillverkning av denna typ av biomaterial byggnadsställning skulle förbättra utvecklingen av mer fysiologiska och tillförlitlig 3D vävnad modeller att hjälpa läkemedelsindustrin att utveckla bättre behandlingsmetoder för regenerativ medicin, cancer eller medicinsk behandling.
The authors have nothing to disclose.
Den forskning som utförs av författarna var stöds delvis genom bidrag från den Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) Grant avtal nr 229239, och från AO Foundation, förberedande forskning Collaborative Research Program akut Brosk skada/lesion/defekt (CRP ACI) inom ramen för projektet Bioactive och biomimetiska ställningar för brosk regenerering (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |