Udvikling af mikrofluid enheder til at studere brudforlængelse evne til Tip-voksende planteceller i ekstremt små rum
Summary
Vi beskriver en metode til at undersøge muligheden for tip-voksende planteceller, herunder pollen rør, rodtråde, og mos protonemata til aflang gennem ekstremt smalle huller (~ 1 µm) i en mikrofluid enhed.
Abstract
In vivo, tip-voksende plantecellerne behøver for at overvinde en række fysiske barrierer; men forskere mangler metode til at visualisere cellulære adfærd i sådanne restriktive betingelser. For at løse dette problem, har vi udviklet vækst kamre for tip-voksende planteceller, der indeholder en serie af smalle, mikro-fabrikerede huller (~ 1 µm) i poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrat. Dette gennemsigtige materiale tillader brugeren at overvåge tip brudforlængelse processer i enkelte celler under microgap penetration af time-lapse billeddannelse. Brug denne eksperimentelle platform, observerede vi morfologiske ændringer i pollen rør, som de trængte ind i microgap. Vi fangede de dynamiske ændringer i form af en fluorescently mærket vegetativ kerne og sædceller i et pollen rør under denne proces. Desuden demonstrerede vi rodtråde og mos protonemata evne til at trænge ind 1 µm kløften. Denne in vitro- platform kan bruges til at studere hvordan de enkelte celler reagerer på fysisk begrænset rum og kan give indsigt i tip-vækst mekanismer.
Introduction
Efter pollenkorn spire på en stigmatisering, producerer hvert korn en enkelt pollen rør, der bærer sædceller ægcellen og den centrale celle i ovule dobbelt befrugtning. Pollen rør aflang gennem stilen og til sidst nå ovule af sensing flere vejledning stikord langs deres vej1. Under strækforlængelse støder pollen rør en række fysiske barrierer; de fremsendende spor er fyldt med celler, og pollen rør skal angive minut micropylar åbningen af ovule at nå deres mål (figur 1A)2. Derfor, pollen rør skal have mulighed for at trænge fysiske forhindringer, mens tolerere trykstyrke stress fra omgivelserne. Rodtråde er en anden type af tip-voksende plante celle, der skal modstå fysiske hindringer i miljøet, i form af pakket jordpartikler (figur 1B).
Forskellige mekaniske egenskaber af pollen røret er blevet undersøgt, herunder turgor pres og stivhed af cellens apikale region, som kan måles ved hjælp af begyndende plasmolysis metode3,4 og cellulære force mikroskopi (CFM) 5 , 6, henholdsvis. Men disse metoder alene ikke afsløre om pollen rør er i stand til at forlængede gennem fysiske barrierer langs deres vækst stier. En alternativ teknik, der tillader pollen tube brudforlængelse skal overvåges i vivo er to foton mikroskopi7. Med denne metode, er det imidlertid vanskeligt at observere de morfologiske ændringer i individuelle pollen rør dybt inde i ovule væv. Derudover kan rod hårvækst i jord visualiseres med X-ray beregnet tomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MR)8, omend med lav opløsning. Vi præsenterer her, en metode, der kan bruges til at erhverve højopløselige billeder af en celle deformation proces på en konventionel mikroskop.
Det overordnede mål med metoden beskrevet her er at visualisere brudforlængelse evne til tip-voksende planteceller, herunder pollen rør, rodtråde, og mos protonemata i ekstremt små rum. Som poly-dimethylsiloxane (PDMS) microdevices præsenteret i dette håndskrift er optisk gennemsigtige og luft gennemtrængelige, vi kan kultur levende celler inde i enheden, og observere deres vækst adfærd under et mikroskop. Det er også muligt at oprette micro ~ nanometer skala rum af bløde litografi teknik9 med brug af forme. Disse funktioner tillade os at studere brudforlængelse evne til tip-voksende planteceller i en fysisk begrænset miljø.
I dette arbejde, vi bygget 1 µm store huller (4 µm i højden) i mikrofluid enheder og undersøgt pollen rør evne til at trænge ind på disse kunstige hindringer, der er meget mindre end diameteren af den cylindriske pollen tube (ca 8 µm). Denne eksperimentelle platform gør det muligt at visualisere pollen tube’s svar til microgaps og fange time-lapse billeder af svaret, som registrere cellens deformation proces. Vi har også udviklet den microdevices, der kan bruges til at undersøge penetration formåen rodtråde og mos protonemata. Flere microdevices er blevet rapporteret til dato, der aktiverer visualisering af root10,11,12,13 og mos protonemata14 plantevækst i høj opløsning. I vores enhed, en serie af rod hår vækst kanaler er vinkelret tilsluttet et rod vækst kammer, og enkelte rodtråde (ca. 7 µm i diameter) er styret at fluidic kanaler med en 1 µm store kløft. Vi også kulturperler mos protonemata (ca. 20 µm i diameter) i en microdevice, der indeholder microgaps for at undersøge deres svar til disse fysiske barrierer. Den foreslåede mikrofluid-baseret tilgang giver os mulighed at udforske forskellige tip-voksende planteceller evne til at aflang gennem meget små rum, som ikke kan blive undersøgt af eventuelle andre foreliggende metode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere kritiske trin i protokollen skal følges netop for at opnå resultater præsenteret ovenfor. Først, PDMS lag og glas bund fad overflader skal begge dele behandles med plasma for en tilstrækkelig mængde af tid, før limning. Ellers, PDMS lag kan lokalt løsnes fra glasoverfladen mens tip-voksende celler krydser microgaps. En anden afgørende skridt i rod hår og mos protonemata protokol er sterilisering af microdevice. Normalt, skal rodtråde og mos protonemata celler være kulturperler i microdevice for et par u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker H. Tsutsui og D. Kurihara for at forsyne os med transgene planter, herunder T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato -linjen og linjen A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , henholdsvis. Dette arbejde blev støttet af Institute af Transformative Bio-molekylerne af Nagoya University og Japan avanceret anlæg videnskab netværk. Finansiel støtte til dette arbejde blev leveret af tilskud fra Japan videnskab og teknologi Agency (ERATO projektet give nr. JPMJER1004 for T.H.), en licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (Nos. JP16H06465 og JP16H06464 for T.H.), og Japan samfund til fremme af videnskab (JSP’ER) Grants-in-Aid for udfordrende sonderende forskning (grant no. 26600061 for N.Y. og grant nr. 25650075 og 15 K 14542 for Y.S.).
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feijó, J. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
