Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren
Summary
Wir beschreiben eine Methode, um die Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen, einschließlich der pollenschläuche, Wurzelhaare, untersuchen und Moos Protonemata, zu verlängern, durch extrem schmale Lücken (~ 1 µm) in einem mikrofluidischen Gerät.
Abstract
In Vivo, Spitze wachsenden pflanzlichen Zellen müssen eine Reihe von physischen Barrieren zu überwinden; Allerdings fehlen Forscher die Methodik um zelluläre Verhalten in solchen restriktiven Bedingungen zu visualisieren. Um dieses Problem zu beheben, haben wir Klimakammern für Tipp-wachsende Pflanzenzellen, die eine Reihe von schmalen, Mikro-fabrizierten Lücken (~ 1 µm) enthalten in einem Poly-Dimethylsiloxane (PDMS) Substrat entwickelt. Das transparente Material ermöglicht dem Benutzer, Tipp Dehnung Prozesse in einzelnen Zellen während der Mikrospalt Penetration durch Time-Lapse-Bildgebung zu überwachen. Mit Hilfe dieser experimentelle Plattform, beobachteten wir morphologische Veränderungen in pollenschläuche, wie sie der Mikrospalt eingedrungen. Die dynamischen Veränderungen in der Form eines eindringmittel beschrifteten vegetativen Kerns und Spermien in einem Pollen Rohr eingefangen wir während dieses Prozesses. Darüber hinaus haben wir die Fähigkeit der Wurzelhaare und Moos Protonemata, 1 µm Spalt durchdringen. Dieser in-vitro- Plattform verwendet werden, wie die einzelnen Zellen reagieren auf körperlich eingeschränkte Räume zu studieren und vielleicht geben Einblicke in Tipp-Wachstum-Mechanismen.
Introduction
Nachdem Pollenkörner auf ein Stigma Keimen, produziert jedes Korn ein Pollen Rohr, die Spermien in die Eizelle und die zentrale Zelle in das Ovulum für doppelte Befruchtung führt. Pollenschläuche verlängern durch den Stil und erreichen schließlich das Ovulum durch Sensierung mehrere Anleitungen Hinweise entlang ihrem Weg1. Während die Dehnung auftreten pollenschläuche eine Reihe von physischen Barrieren; die übertragende Strecke ist mit Zellen gefüllt und pollenschläuche müssen die Minute micropylar Eröffnung das Ovulum, erreichen ihr Ziel (Abbildung 1A)2eingeben. Daher müssen die pollenschläuche die Fähigkeit, physische Hindernisse, eindringen, während die Druckspannung aus ihrer Umgebung zu tolerieren. Wurzelhaare sind eine andere Art von Spitze wachsenden Pflanzenzelle, die physische Hindernisse in der Umgebung in Form von verpackten Bodenteilchen (Abbildung 1 b) standhalten muss.
Verschiedenen mechanische Eigenschaften des Rohres Pollen sind untersucht worden, darunter Turgor Druck und Steifigkeit der apikalen Region der Zelle, die mit dem beginnenden Plasmolyse Methode3,4 und zelluläre Rasterkraftmikroskopie gemessen werden kann, (CFM) 5 , 6, beziehungsweise. Diese Methoden allein zeigen jedoch nicht ob pollenschläuche durch physische Hindernisse entlang ihrer Wachstumspfade verlängern werden. Eine alternative Technik, mit dem Pollen Rohr Dehnung überwachten in Vivo zu kann ist zwei-Photonen-Mikroskopie-7. Mit dieser Methode ist jedoch schwierig zu beobachten, die morphologischen Veränderungen in einzelnen pollenschläuche tief in das Ovulum Gewebe. Darüber hinaus kann Root Haarwachstum im Boden mit visualisiert werden berechnet Röntgen-Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT)8, wenn auch mit geringer Auflösung. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die verwendet werden, um hochauflösende Bilder von einer Zelle Verformung Prozess auf einem herkömmlichen Mikroskop zu erwerben.
Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist es, die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen, einschließlich der pollenschläuche, Wurzelhaare, zu visualisieren und Moos Protonemata, in sehr kleinen Räumen. Da die Poly-Dimethylsiloxane (PDMS) abformverfahren präsentiert in dieser Handschrift optisch transparent sind und durchlässig, wir können Kultur lebenden Zellen im Inneren des Gerätes und ihr Wachstum Verhalten unter einem Mikroskop zu beobachten. Es ist auch möglich, Mikro erstellen ~ Nanometer Skala Räume durch die weiche Lithographie-Technik9 mit der Verwendung von Formen. Diese Funktionen ermöglichen es uns, die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in einer physisch beengten Umgebung zu studieren.
In dieser Arbeit, die wir gebaut 1 µm Breite Lücken (4 µm in der Höhe) in mikrofluidischen Geräten und untersucht die Fähigkeit der pollenschläuche, diese künstliche Hindernisse durchdringen, die viel kleiner sind als der Durchmesser des zylindrischen Pollen Rohr (ca. 8 µm). Diese experimentelle Plattform ermöglicht uns zu visualisieren die Pollen Rohr Reaktion auf Mikropausen und Zeitraffer-Bilder der Antwort, die die Zelle Verformung Prozess verfolgen zu erfassen. Wir haben auch die abformverfahren, die verwendet werden können, zu untersuchen, die Penetration Fähigkeit der Wurzelhaare und Moos Protonemata entwickelt. Mehrere abformverfahren wurden gemeldet, bis heute, die es ermöglichen die Visualisierung der Wurzel10,11,12,Moos und13 Protonemata14 Pflanzenwachstum mit hoher Auflösung. In unserem Gerät eine Reihe von Wurzelhaare Wachstum Kanäle senkrecht zu einer Wurzel Wachstum Kammer verbunden sind, und einzelne Wurzelhaare (etwa 7 µm im Durchmesser) orientieren sich fluidische Kanäle mit einer 1 µm breite Lücke. Wir kultiviert auch Moos Protonemata (ca. 20 µm im Durchmesser) in einer mikroapparat mit Mikropausen um ihre Reaktionen auf diese physischen Barrieren zu untersuchen. Der vorgeschlagene mikrofluidischen basierenden Ansatz erlaubt uns, erkunden die Fähigkeit der verschiedenen Tipp wachsenden Pflanzenzellen zu verlängern durch extrem kleine Räume, die von keiner anderen derzeit verfügbaren Methode geprüft werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere wichtige Schritte im Protokoll müssen befolgt werden, um genau die oben dargestellten Ergebnisse zu erzielen. Erstens müssen die PDMS Schicht und Glas Schüssel Bodenflächen sowohl mit Plasma für eine ausreichende Menge an Zeit vor der Verklebung behandelt werden. Andernfalls kann die PDMS-Schicht lokal von der Glasoberfläche lösen, während Tipp erzeugenden Zellen die Mikropausen kreuzen. Ein weiterer entscheidender Schritt in der Wurzelhaare und Moos Protonemata-Protokoll ist die Sterilisation von der mik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
H. Tsutsui und D. Kurihara danken wir für die uns mit transgenen Pflanzen, einschließlich der T. fournieriRPS5Ap::H2B-TdTomato -Linie und die Linie A. Thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , beziehungsweise. Diese Arbeit wurde durch das Institut der transformativen Biomoleküle der Universität Nagoya und Japan Advanced Plant Science Network unterstützt. Finanzieller Unterstützung für diese Arbeit wurde durch Zuschüsse zur Verfügung gestellt, von der Japan Science and Technology Agency (ERATO Projekt gewähren keine. JPMJER1004 für t.h.), eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Nos. JP16H06465 und JP16H06464 für t.h.), und Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid für anspruchsvolle Pionierforschung (Grant Nr. 26600061 für New York und Grant Nr. 25650075 und 15 K 14542 für YS).
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
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