在本研究中, 我们描述了一种分析 C924T 基因型的方法。该协议包括三个阶段: DNA 提取、聚合酶链反应扩增 (PCR) 和琼脂糖凝胶限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析。
血栓素 A2 受体 (TBXA2R) 基因是具有7个跨膜区域的 g 蛋白耦合超家族的成员。它参与动脉粥样硬化的进展, 缺血, 和心肌梗死。在这里, 我们提出了一个方法的患者基因分型, 以调查转录后的功能 (rs4523) 位于 3 ‘ 区域的 TBXA2 受体基因。该方法依靠从全血中提取 DNA, 对含有 C924T 突变的 TBXA2 基因部分进行扩增, 并利用限制性消化分析鉴定野生类型和/或突变基因型,特别是琼脂糖凝胶上的限制片段长度多态性 (RFLP)。此外, TBXA2R 基因测序证实了这一结果。该方法具有高效、PCR 和限制性酶分析快速识别 C924T 多态性等优点。通过分析 TBXA2R C924T 多态性的患者基因型, 可以对牙菌斑形成和动脉粥样硬化进展进行预测研究。应用这种方法有可能识别更容易受到动脉粥样硬化过程的受试者, 特别是高风险、阿司匹林治疗组的受试者。
Tbxa2r 是 g 蛋白耦合超家族的成员, 具有7个跨膜区域, 在细胞膜或细胞内结构1,2上广泛表达和定位。TBXA2R 信号通路参与了晚期动脉粥样硬化过程3。TBXA2 受体在动脉粥样硬化过程中表达增加, 临床和实验研究表明, TBXA2 受体在缺血和心肌梗死4中的相关作用。C924T 是 TBXA2R 基因的单核苷酸多态性 (SNP), 在健康志愿者中被认为是一种功能多态性, 并与临床疾病有关 5。此外, 我们以前的研究6表明, tbxa2r 基因的 c924t 多态性参与了转录稳定性;具体而言, 突变体 (TT) 型转录与野生类型 (CC) 相比有增加的不稳定性。此外, 一些刺激, 如二磷酸腺苷 (ADP), 肾上腺素和胶原蛋白在不同浓度诱导血小板聚集不太有效的突变型 (TT)。这与减少血栓形成和止血是一致的。因此, TBXA2R 转录的不稳定性和血小板聚集的相关减少可能与 TBXA2R TT 基因型对动脉粥样硬化形成及其并发症的保护作用有关..
在这里, 我们描述了一种方法, 为患者基因分型, 以调查 C924T 多态性 (rs4523) 的转录后作用位于 3 ‘ 区域的 TBXA2 受体基因。该方法依赖于以下步骤: (1) 从全血中提取 DNA, (2) PCR 扩增含有 C924T 突变的 TBXA2R 基因部分, (3) 利用限制片段长度鉴定野生类型和突变体基因型琼脂糖凝胶的多态性 (RFLP)。RFLP 是一种利用同源 DNA 序列7的变异的技术.该应用程序被用来检测 DNA 多态性, 特别是 Snp, 并发现和关联遗传变异8的生物学相关性.首次使用 RFLP-PCR 对人体进行了多态性分析, 为 ABO 血 9.RFLP-PCR 方法允许通过使用高度特异性的限制性内切酶10评估 dna 消化后不同长度的片段来分析同源 DNA 序列中的基因突变.
在过去几年中, 使用 PCR 技术进行 SNP 分析时采用了以下方法: 短等位基因特异性寡核苷酸11、等位基因特异性 pcr 12、dna 微阵列13引物扩展的杂交,寡核苷酸结扎法14, 直接 dna 测序用于识别位置特异性单核苷酸多态性15, taqman 方法16, 提取矩阵辅助激光去离子-电离时间————————————————————————————————————————质谱分析17和基因芯片18。这些技术使用起来并不简单, 可能需要昂贵的设备。相反, PCR-RFLP 方法价格低廉, 使用简单, 使用方便, 具有高效率, 并允许快速识别 C924T 多态性。此外, 我们还通过使用 Sanger 方法15对 tbxa2r 基因进行测序来确认结果。
通过分析 TBXA2R C924T 多态性的患者基因型, 可以对斑块形成和动脉粥样硬化进展进行预测研究。这种方法可以识别更容易受到动脉粥样硬化过程的研究对象, 特别是那些高风险、阿司匹林治疗的患者。
在本研究中, 我们描述了一种方法, 允许患者基因分型, 以调查 C924T 多态性 (rs4523) 的转录后作用位于 TBXA2R 基因的 3 ‘ 区域。首先, 这种方法依赖于从全血中提取 DNA。特别是, 第一个过程包括纯化人类的总 DNA, 基因组和线粒体, 从全血样本新鲜或冷冻, 用 EDTA (柠檬酸或肝素) 处理。对于全血样本的短期储存, 在2-8°c 下储存长达10天。在储存超过10天的情况下, 请将样品存放在-70°c。自动纯化过程包括4个步骤: 裂解、捆绑、清洗和洗脱。其次, 该方法依赖于含有 C924T 突变的 TBXA2R 基因部分的 PCR 扩增。最后, 利用限制性酶分析 (RFLP) 对琼脂糖凝胶进行了野生类型和突变基因型鉴定。
协议中的关键步骤如下: (i) 在使用储存在 RT 的琼脂糖凝胶的一部分的情况下, 固化琼脂糖可以在沸水浴 (在60°c 下大约 15-20) 或在浇水前的微波炉中 (3-5分钟) 重新溶解。注意: 在瓶子中重新融化琼脂糖时, 松开瓶盖。(ii) 此外, 当再加热琼脂糖时, 蒸发会导致其浓度增加。因此, 通过添加少量的水进行补偿可能是有用的。(三) 利用琼脂糖凝胶对小于 1, 000 bp 的 DNA 片段进行了鉴别, 建议使用 TBE 缓冲液进行最佳分离。(四) 我们更喜欢使用琼脂糖凝胶, 而不是聚丙烯酰胺凝胶, 因为后者的制备比较困难, 设置起来需要更长的时间。(v) 凝胶电泳运行时间的选择取决于放大产物的预期尺寸。根据该协议, 在2% 琼脂糖凝胶中, PCR 片段的大小从 10-500 bp 不等, 因此必须从人体样本中提取10至50纳克的优质模板 DNA, 从而在 100 v 时进行20-30 的电泳。.出于这个原因, 我们更喜欢使用自动 DNA 纯化, 而不是半自动或手动的。(vii) 准备 PCR 扩增的主混合反应和 PCR 产品消化的主混合溶液, 在计算的体积中再增加 10% (以考虑移液过程中的液体损失) 乘以所需体积的样品数量一个 DNA 样本
该方法最常见的缺陷是由于不正确的热循环程序、不正确的扩增主混合制剂或 DNA 模板污染而产生了额外的放大产品。此外, PCR 产品的缺失可能是由于分离的Taq聚合酶或不正确的热循环运行。此外, 意外片段的存在可能是由于 PCR 产品污染或不激活酶的消化不完整、限制性酶体积过少或孵育时间太短。
在过去几年中, 使用 PCR 技术进行 SNP 分析时采用了以下方法: 短等位基因特异性寡核苷酸11、等位基因特异性 pcr 12、dna 微阵列上的引物扩展 13, 寡核苷酸结扎法 14, 直接 DNA 测序鉴定位置特异性单核苷酸多态性 15, taqman 方法16, 提取矩阵辅助激光去光/电离时飞行 (MALDI-TOF) 质谱法 17和 genecp18。这些方法并不理想, 因为它们使用起来并不简单, 也不需要昂贵的设备。相反, 本研究中描述的 PCR-RFLP 方法价格低廉, 使用简单, 使用方便, 效率高, 并允许快速识别 C924T 多态性。对目前方法的一个限制是, 它只能用于少量的 Spp 和工作会话中的几个样本。
对于未来的应用, 该方法可用于预测牙菌斑形成和动脉粥样硬化进展的分析患者基因型的 tbxa2r C924T 多态性。此外, 这种方法可以确定更容易受到动脉粥样硬化过程的研究对象, 特别是使用阿司匹林治疗的高危患者。最后, 该方法可用于研究特定药物 (如抗凝剂和抗惊厥药) 的个性化药物中涉及的其他多态性, 以了解适当的药物剂量和个体药理作用。每个患者在开始治疗前的临床反应, 并避免不良反应。
The authors have nothing to disclose.
该项目由意大利大学管理公司60% 的 Ateneo 赠款资助, 由意大利 s. m. 和 e. t. 提供。我们还收到了 Chieti 大学 “G. d ‘ Annunzio” 医学、口头和生物技术科学系对研究费用的部分捐款。
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |