בהווה לומדים, נתאר מתודולוגיה לניתוח של גנוטיפ C924T. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים: הפקת דנ א, ההגברה ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), וניתוח של ההגבלה שבר אורך פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג’ל.
הגן לקולטן (TBXA2R) thromboxane A2 הוא חבר של superfamily G-חלבון בשילוב עם אזורים transmembrane-7. זה מעורב atherogenesis התקדמות, איסכמיה, אוטם שריר הלב. כאן אנו מציגים מתודולוגיה של החולה genotyping לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3′ של הגן הקולטן TBXA2. שיטה זו מתבססת על מיצוי DNA מדם שלם, פולימראז הגברה תגובת שרשרת (PCR) של החלק ג’ין TBXA2 שמכילה מוטציה C924T, וזיהוי של פראי סוג ו/או מוטציה אחרים באמצעות ניתוח תקציר ההגבלה, באופן ספציפי הגבלת שבר אורך פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג’ל. בנוסף, התוצאות שאושרו על-ידי קביעת רצף הגן TBXA2R. שיטה זו כוללת מספר יתרונות פוטנציאליים, כגון יעילות גבוהה, זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T על ידי ה-PCR וניתוח אנזים הגבלה. גישה זו מאפשרת ניבוי מחקר על היווצרות הפלאק והתקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח החולה אחרים עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. יישום השיטה הזאת יש את היכולת לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, במקצועות מסוים בקבוצת סיכון גבוה, שטופלו אספירין.
TBXA2R הוא חבר של superfamily G-חלבון בשילוב עם אזורים 7-transmembrane, אשר הביע נרחב ו לשפות אחרות או על קרום התא או על מבנים תאיים1,2. מסלול איתות TBXA2R מעורב תהליכי טרשת עורקים מתקדמת3. ביטוי מוגבר של הקולטן TBXA2 הפגינו במהלך ההתקדמות atherogenesis, ומחקרים קליניים, ניסיוני מחקרים הראו תפקידה הרלוונטיים איסכמיה, אוטם שריר הלב4. C924T, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (הסנ פ) של הגן TBXA2R, הוכרו פולימורפיזם פונקציונלי מתנדבים בריאים, נקשר הפרעות קליניות5. יתר על כן, המחקר הקודם שלנו6 הפגינו פולימורפיזם C924T של הגן TBXA2R עוסקת התעתיק יציבות; באופן ספציפי, יש יציבות מוגברת של תמליל סוג מוטציה (TT) ביחס לסוג הפרוע (CC). בנוסף, מספר גירויים כגון אדנוזין diphosphate (ADP), אפינפרין, קולגן בריכוזים שונים המושרה צבירה טסיות פחות יעילים עבור סוג המוטציה (TT). . זה עקבי. עם היווצרות כגון מופחת, hemostasis. לפיכך, את חוסר היציבות של התעתיק. TBXA2R וצמצום המשויך של טסיות מצבור שעשויים להיות מקושרים עם תפקיד המגן גנוטיפ TBXA2R TT נגד atherothrombosis וסיבוכים שלה בחולים בסיכון גבוה שטופלו אספירין6 .
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה genotyping המטופל לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3′ של הגן הקולטן TBXA2. שיטה זו מתבססת על השלבים הבאים: (1) DNA החילוץ של דם, (2) PCR הגברה של החלק ג’ין TBXA2R המכיל את המוטציה C924T, וזיהוי (3) פראי סוג ו/או מוטציה אחרים באמצעות הגבלת אורך קטע פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג’ל. RFLP היא טכניקה המנצלת וריאציות של רצפי DNA הומולוגי7. יישום זה נעשה שימוש כדי לאתר את ה-DNA פולימורפיזמים, במיוחד SNPs, וכדי למצוא ולשייך רלוונטיות ביולוגי וריאציות גנטיות8. פולימורפיזם מנותח בפעם הראשונה באמצעות RFLP-PCR בבני אדם היה דם ABO9. השיטה RFLP-PCR מאפשרת הניתוח של מוטציות גנטיות רצפי DNA הומולוגי המעריכה את הנוכחות של שברי באורכים שונים לאחר עיכול הדנ א באמצעות הגבלת ספציפי מאוד endonucleases10.
בהשנים האחרונות, למתודולוגיות הבאים כבר נעזרו הסנ פ ניתוח באמצעות טכניקת ה-PCR: הכלאה של קצר אלל ספציפי oligonucleotides11, אלל ספציפי PCR12, הארכת תחל ב DNA מיקרו-מערכים13, מצדו oligonucleotide assay14, ישיר DNA רצף עבור מיקום ספציפי נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים מזהה15, שיטת Taqman16, מיצוי (Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון זמן-של-טיסה MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה17, ו- GeneChips18. טכניקות אלה אינם פשוטים לשימוש, מחייבים ציוד יקר. לעומת זאת, בשיטת PCR-RFLP זולה, פשוטה לשימוש, נוח, יש יעילות גבוהה, ומאפשר זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T. בנוסף, אנחנו אישר את התוצאות על-ידי קביעת רצף הגן TBXA2R באמצעות שיטת סנגר ה15.
גישה זו מאפשרת מחקר חזוי של היווצרות הפלאק והתקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח החולה אחרים עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. שיטה זו יכולה לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, בפרט אלו בקרב חולים בסיכון גבוה, שטופלו אספירין.
במחקר הנוכחי, תארנו מתודולוגיה המאפשרת genotyping המטופל על מנת לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3′ של הגן TBXA2R. ראשית, שיטה זו מסתמכת על מיצוי הדנ א של דם מלא. בפרט, התהליך הראשון מורכב הוא לטיהור סה כ- dna אנושי, גנומית, מיטוכונדריאלי, מדגימות דם טרי או קפוא, מטופלים עם EDTA (ציטראט או הפארין). לאחסון לטווח קצר של דגימות דם, לאחסן ב 2-8 ° C עד 10 ימים. עבור אחסון לאחסן מעל 10 ימים, דגימות ב-70 מעלות צלזיוס. תהליך טיהור אוטומטיות כולל 4 שלבים: lyse לאגד, לשטוף, elute. שנית, השיטה מסתמכת על PCR הגברה של החלק ג’ין TBXA2R המכיל את המוטציה C924T. לבסוף, מתבצע זיהוי פראי סוג ו/או מוטציה גנוטיפ באמצעות ניתוח אנזים הגבלה (RFLP) על agarose ג’ל.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם הבאים: (i) במקרה שבו חלק של הג’ל agarose המאוחסן ב- RT משמש, agarose הקרושה יכול להיות מחדש מומס מעל אמבט מים רותחים (ב 60 מעלות צלזיוס במשך כ- 15-20 דקות) או בתנור מיקרוגל (3-5 דקות) לפני לשפוך. הערה: שחרר את הכובע כאשר מחדש נמס agarose בבקבוק. (ii), יתר על כן, כאשר חימום מחדש agarose, אידוי תגרום להגדלת הריכוז שלו. מסיבה זו, זה יכול להיות שימושי לפצות על-ידי הוספת נפח קטן של מים. (iii) DNA שברי פחות מ-1,000 bp היו מובחנת על ידי ג’ל agarose, מאגר TBE מומלץ על מנת לקבל את ההפרדה האפשרי הטוב ביותר. (iv) אנו מעדיפים להשתמש עם ג’ל agarose ולא ג’ל לזיהוי כי ההכנה של האחרונים קשה יותר, וזה לוקח הרבה זמן כדי להגדיר. (v) הבחירה של. משך בג’ל מסתמך על הגודל הצפוי של מוצרי הגברה. בהתבסס על פרוטוקול זה, זה מספיק לבצע אלקטרופורזה של 20-30 דקות ב- 100 וולט ב- 2% agarose ג’ל, כיוון הגודל של ה-PCR שברים נע בין 100-500 bp. (vi) היא חובה כדי לקבל 10 עד 50 ng של תבנית באיכות טובה שחולצו מן האדם דגימות ה-DNA . מסיבה זו, אנו מעדיפים להשתמש טיהור DNA אוטומטית במקום אחד חצי אוטומטית או ידנית. (vii) הכנת התגובה מאסטר-mix עבור הגברה PCR והפתרון מאסטר-מיקס לעיכול מוצרי ה-PCR, הוספת 10% יותר (לקחת בחשבון אובדן נוזלים במהלך pipetting) עוצמת הקול מחושב מוכפל במספר הדגימות עבור אמצעי האחסון הנדרש עבור אחד. דנ א.
מהמלכודת בתדירות הגבוהה ביותר של השיטה היא הנוכחות של מוצרי הגברה נוספת עקב תוכנית של שגוי הצנטרפוגה תרמי, הכנה מאסטר-מיקס של שגוי הגברה או זיהום תבנית ה-DNA. יתר על כן, העדר של מוצרי ה-PCR יכול להיות בגלל . אנזימים מוחלש או הצנטרפוגה תרמי שגוי של רוץ. בנוסף, הנוכחות של קטעים לא צפוי יכול להיות עקב זיהום מוצר ה-PCR או עיכול לא שלם של אנזים מוחלש, כמות קטנה מדי של אנזים הגבלה נפח, או זמן דגירה קצר מדי.
בשנים האחרונות, למתודולוגיות הבאים כבר נעזרו הסנ פ ניתוח באמצעות טכניקת ה-PCR: הכלאה של קצר אלל ספציפי oligonucleotides11, אלל ספציפי PCR12, הארכת תחל ב- DNA מיקרו-מערכים13 , oligonucleotide מצדו assay14, ישיר רצפי DNA לזיהוי מיקום ספציפי נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים15, שיטת Taqman16, מיצוי Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון… ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה (MALDI-TOF)17, GeneChips18. שיטות אלה אינן אידיאלי מכיוון שהם אינם פשוטים להשתמש ו/או דורשים ציוד יקר. לעומת זאת, בשיטת PCR-RFLP המתוארים במחקר זה היא זולה, פשוטה לשימוש, נוח, יש יעילות גבוהה ומאפשרת זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T. מגבלה בשיטה הנוכחית היא כי זה יכול לשמש רק על מספר קטן של SNPs ועל כמה דוגמאות בהפעלה של עבודה.
עבור יישומים עתידיים, שיטה זו יכול לשמש ללימודי חזוי בדבר היווצרות הפלאק התקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח של אחרים החולה עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. יתר על כן, שיטה זו יכולה לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, בפרט, חולים בסיכון גבוה שטופלו עם אספירין. בסופו של דבר, יכול להיות מיושם בשיטה זו ללמוד אחרים פולימורפיזמים מעורב רפואה אישית עבור תרופות ספציפיות (לדוגמה, תרופות נגד קרישת דם, פרכוסים) על מנת להבין את המינון המתאים סמים ואת הפרט תרופתי ו תגובה קלינית עבור כל מטופל לפני תחילת הטיפול, כדי למנוע תופעות לוואי.
The authors have nothing to disclose.
הפרויקט מומן חלקית על ידי 60% Ateneo מעניקה מ Ministero dell’ באיטלקית, איטליה בארקדיה, אי. טי גם קיבלנו תרומה חלקית מחקר הוצאות על ידי מחלקת הרפואה, אורלי הביו-טכנולוגיה ומדעים, אוניברסיטת Chieti “ד ‘ אנונציו G…”.
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |