הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה photoconversion של חלבון פלואורסצנטי קאךה בתאים endocardial של החיים העובר דג זברה המאפשרת המעקב של תאים endocardial במהלך תעלת atrioventricular ופיתוח שסתום הלב atrioventricular .
Abstract
במהלך מופרה, התאים עוברים שינויים דינמיים בהתנהגות התא, פיענוח הסלולר ההיגיון מאחורי שינויים אלה היא מטרה היסוד בתחום ביולוגיה התפתחותית. בגילוי ופיתוח של חלבונים photoconvertible במידה רבה כאילו סייע ההבנה שלנו של שינויים דינמיים אלה על-ידי מתן שיטה לסימון שטיחות תאים ורקמות. עם זאת, בעוד photoconversion, מיקרוסקופיה זמן לשגות, ניתוח תמונות עוקבות הוכיחו להיות מאוד מוצלח שיגורי דינמיקה סלולר באיברים כמו המוח או את העין, גישה זו משמשת בדרך כלל לא בלב המתפתח עקב לאתגרים שמציב את התנועה המהירה של הלב במהלך מחזור הלב. פרוטוקול זה מורכב משני חלקים. החלק הראשון מתאר שיטה photoconverting ומעקב לאחר מכן תאים endocardial (והריון) במהלך דג זברה תעלת atrioventricular (AVC) ופיתוח שסתום הלב atrioventricular. השיטה כוללת חנותם עוצר את הלב עם סמים על מנת photoconversion מדויק להתקיים. לבבות מותר לחדש את המכות על הסרת התרופה ואת התפתחות נמשכת בדרך כלל עד הלב הוא נעצר שוב עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של photoconverted והריון בשלב מאוחר יותר זמן התפתחותית. החלק השני של הפרוטוקול מתאר שיטת ניתוח התמונה כדי לכמת את האורך של אזור photoconverted או אי-photoconverted AVC ב צעירים העוברים על-ידי מיפוי האות פלורסנט מתוך מבנה תלת-ממדי על גבי מפה דו-ממדית . יחד, שני חלקי הפרוטוקול מאפשר לבחון את מקור וההתנהגות של תאים המרכיבים את דג זברה AVC ואת מסתמי הלב atrioventricular ולאחר פוטנציאלי יכול להיות מיושם עבור לומד מוטציות, morphants או עוברי שטופלו עם ריאגנטים לשבש את התפתחות AVC ו/או שסתום.
Introduction
דג זברה נחשב כיום לאחד הדגמים חוליות החשוב ביותר ללמוד הסלולר תהליכים התפתחותיים ויוו. זה נובע במידה רבה שקיפות אופטית של דג זברה ולקודדו amenability על גנטיקה, מה שהופך אותו במודל רב עוצמה על יישום טכניקות אופטי מעורבים גנטית photoresponsive חלבון טכנולוגיות1. ספציפיים בחקר התפתחות הלב, דג זברה מקבלים מספיק חמצן באמצעות דיפוזיה כזה כי מוטציות אפילו ללא דופק יכולים לשרוד עד השבוע הראשון של פיתוח, התרת ניתוחים על ההשפעות של גנים התפתחותית, מודאג זרימת הדם על הלב מורפוגנזה לא אפשרי חולייתנים רוב2.
הצינור הלב דג זברה נוצר על ידי הפריה פוסט 24 שעות (hpf). זמן קצר לאחר הקמתו, הצינור הלב מתחיל לפעום באופן פעיל. על ידי 36 hpf, כיווץ ברור שמפריד האטריום מן החדר. אזור זה של הכיווץ נקראת התעלה atrioventricular (AVC), ועל תאים שינוי אזור זה של מורפולוגיה קשקשיים מורפולוגיה cuboidal3. דג זברה שסתום atrioventricular מורפוגנזה מתחיל בסביבות 48 שעות פוסט הפריה. על ידי 5 ימים פוסט הפריה, משני עלעלים שסתום להרחיב AVC, למנוע את זרימת הדם מן הנוזלים לאטריום גב במהלך מחזור לב4. מעקב אחר תאים במהלך היווצרות AVC שסתום הוא מאתגר כמו המכות מהיר של הלב ומקשה לעקוב אחר תאים באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות המסורתית5,6. פרוטוקול זה, משנת סטיד. et al., 20167, מתאר שיטה המשתמשת Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 דג זברה מהונדס הקו, שבו מתבטאת החלבון photoconvertible קאךה תאי אנדותל, כולל את endocardium. התרופה 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM) משמש כדי לעצור באופן זמני את פעימות לבי ומאפשר photoconversion מדויק של והריון בין 36 ל 55 hpf, דימות ברזולוציה של photoconverted והריון בנקודות זמן התפתחותית מסוימת. בעבר הוכח כי photoconverted והריון בשיטה זו יכול להישאר להבדיל מהשכנים אשר במשך חמישה ימים או יותר אחרי שעת photoconversion7. פרוטוקול זה מפרט גם שיטה לניתוח תמונה של photoconverted והריון ב עוברי צעיר יותר 48 hpf, אשר שימש בהצלחה כדי לעקוב אחר תנועות רקמות במהלך AVC פיתוח (בוזלי. et al., בעיתונות)9. אנו מקווים כי הקוראים שימושיות פרוטוקול זה ללמוד AVC ופיתוח שסתום עוברי רגילה, וכן מוטציות, morphants או עוברי שטופלו בסמים. עבור פרוטוקול כלליים יותר הקשורים תא מעקב באמצעות חלבונים photoconvertible במהלך הפיתוח דג זברה, בבקשה להציג את המאמר על ידי לומברדו. et al., 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
העיתוי של photoconversion: קאךה למרות נשאר במאור פנים מתבטאות והריון אפילו ב 96 hpf, יצוין כי ככל שהעובר גדל, אור לייזר מפזרת עוד לפני שהוא מגיע את AVC, יצירת photoconversion מוגבלת של קאךה קשה יותר. At עובריים שלבים מאוחר יותר 55 hpf, שהתנפח של הנוזלים, האטריום גם אומר כי קרן לייזר סגול משמש photoconversion לא יכול לה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות Duchemin הולץ, דניס Duchemin, נטלי Faggianelli, באזיל Gurchenkov שעזרת לתכנן ולבצע כייר שמתואר פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי עקרות (DEQ20140329553), את ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), התוכנית של חוקר צעיר EMBO, הקהילה האירופית, ERC קוג N ° 682938 Evalve ומנוהל על ידי המענק ANR-10-LABX-0030-INRT, קרן צרפתית המדינה על ידי סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש תחת d’Avenir Investissements תוכנית מסגרת בתווית ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. . Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
