부분 Lobular Hepatectomy: Morphologic 간 재생에 대 한 수술 모델

Summary

여기, 우리 신생아 (0 일) 쥐에서 왼쪽된 간 엽의 부분 절제 하는 새로운 방법을 제시. 이 새로운 프로토콜은 급성 간 상해 및 신생아 속에서 상해 응답 공부 적합 합니다.

Abstract

형태학 기관 재생 급성 조직 손실 다음 낮은 척추 동물 중 일반적 이지만 거의 포유류 출생 후 생활에서 관찰 됩니다. 성인 간 재생 70% 부분 hepatectomy 후 남은 엽 대사 활동의 복원 하지만 부상된 엽의 형태와 건축의 영구 손실에 일부 복제 hepatocyte 비 결과. 여기, 우리는 생리 환경 재생에 도움이 되는 신생아에서 새로운 수술 방법 선발. 이 모델 왼쪽된 엽 정점 및 후속 보수적인 관리 처방의 절단을 포함 하 고 주요 간 선박 또는 생리 환경 재생 발생할 수 있습니다 떠나는 화학 상해의 결 찰에 대 한 필요성을 결여 된다. 우리는 자르고 있는 동안 부상된 간 전환 기관 재생에서 보상 성장에 비 대에 의해 청소년 (p 7-14) 쥐에 게이 프로토콜을 확장 합니다. 제시, 짧은 30 분 프로토콜 중생, 포유류에서 그것의 나이 관련 된 감소 및 상 상속 간 줄기 또는 창시자의 특성화의 메커니즘을 연구 하는 프레임 워크를 제공 합니다.

Introduction

기관를 다시 생성 하거나 복원 하는 형태와 기능, 능력 주로 진화 시간이 지남에 손실 될 생각 되었다. 급성 화학 또는 물리적 손상 후 성인 포유류 간의 재생 잠재력 비 대의 파도 세포 분열, 작동 하지만에서 결과의 몇 라운드에서 발생 하는 모든 나머지 hepatocytes의 동원을 포함 발견 되었습니다. 구조적으로 다른 장기^1,2,3,,45. 최근, 연구 특성화 생활^6,,78의 첫 번째 주 내에서 부상 신생아 포유류 장기의 재생 반응 하기 시작 했다. 이러한 연구 신생아 개발 하는 동안 부상 때 특정 포유류 장기 보상 성장 또는 섬유 증^7,8대신 형태학 중생과 반응으로 나타났습니다.

최근 연구 글로벌 구조와 기능 둘 다의 재생 초기 신생아 기간^6,,78중 발생 하는 것으로 나타났습니다. 화학 상해 또는 에탄올^9,,1011, 아 세트 아미노 펜^{12,,1314,15의 설립된 간 부상 프로토콜 포함} , 사염화 탄소^16,,1718,19, 70% 부분 hepatectomy^4,,2021또는 왼쪽의 제거 및 중간로 브입니다. 화학 관리 hepatocyte 세포 죽음에 이르게 되지만 종종 마이크로 및 매크로 구조 그대로. Morphologic 재생 이러한 맥락에서로 전체 간 건축은 말소 되지 쉽게 공부 될 수 없습니다. 70% 부분 hepatectomy 봉합 결 찰, 주요 혈관의 출혈을 멈추게 하는 데 필요한는 포함 되지만 맥 관 구조의 영구 중단 하면서 비 생리 환경. 또한,이 방법은 성인 설치류에만 사용 되 고 신생아의 응용 기술적으로 매우 어렵습니다. 이 염두에서에 두고, 우리 개발 왼쪽된 엽의 꼭대기의 20-30%는 신생아 P0 마우스에서 제거 하는 방법 (그림 1A-1B). 이 메서드와 보수적인 수술, 최소 침 습, 아니라 기술적으로 도전적인, 총 체 맥 관 구조, 발생 하는 재생을 위한 공간을 떠나 결 찰 하지 않고 형태학의 손실에 지도. 아래에서 설명 하는 결과 단계별 프로토콜 출생 후 생활의 초기 단계에서 포유류 신생아 재생을 공부 하기 위하여 부분 lobular hepatectomy 신생아 쥐에 수행 하기 위해 어떤 연구원에 대 한 수 있습니다. 이 방법은 또한 있다 재생 의학 및 줄기 세포 생물학, 비교 연구 분명 응용 프로그램으로 생활의 나중 단계 동안에 사용할 수 있습니다.

가장 일반적인 급성 간 상해 연구는 화학적으로 유도 된 손상, 성인 간 절단, 또는 70% 부분 hepatectomy. 화학 손상 자주 아 세트 아미노 펜, 사염화 탄소, 또는 에탄올, 정 맥, 복 또는 구두 관리를 포함 하 고 비교적 간단 하 고 비-침략 적 부상 모델 이다. 이전, 화학 손상 결과를 hepatocyte 세포 죽음, 하지만 종종 잎 기질 및 실질 구조 그대로, morphologic 중생에 대 한 주장을 하 고 어려운 논의 했다. 화학 손상 종종 간장 혈관에 센터 공부 사이트와 셀 관련 부상, 유용한 기술 하기가 하지만 또한 어려운가, 전체 기관 수준에서 다른 인구는 선박에서 놓일 수 고를 수 있습니다. 재생에 기여 한다. 이러한 제한에도 불구 하 고 화학 손상에 유용 하 고 매우 순수 관련 부상 모델 아직도 남아 있다.

성인 70% 부분 hepatectomy 결 찰 간 맥 관 구조에 따라 왼쪽과 중간 엽의 제거를 포함. 응답 hepatectomy로 잘 특징 되었습니다: 절단된 간 게시물 70% 부분 hepatectomy 나머지 오른쪽 고 꼬리가 돌출부의 hepatocytes로 원래 손상된 엽의 조잡 한 다른 아키텍처를 개발 하는 14 일 비 대 및 세포 분열^4,5의 몇 라운드를 받 다. 이 분실 된 질량와 기능, 하지만 두 절단된 돌출부를 다시 생성 실패 하 고 따라서 총 형태를 대체 하지 않습니다. 그 결과, 70% 부분 hepatectomy 부상 응답 제한 재생으로 보상 성장 메커니즘 연구 유용 합니다.

여기, 우리는 완전히 신생아 부분 lobular hepatectomy에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 절차에는 적절 한 동물 선택 및 준비, 수술 필드 준비, 수술, 및 복구 포함 한다. 각이 단계 적응과 최적화 프로토콜의 다른 응용 프로그램에 대 한 필요할 수 있습니다.

그러나, 다른 세포 인구와 재생성의 메커니즘 연구, 우리 또한 사용 다양 한 Cre를 은닉 하는 쥐를 포함 하 여 다양 한 유전자 변형 동물, 우리는 광범위 하 게 수행 하 고 야생 유형 C57BL/6J 강아지 (잭 스 000664)에이 프로토콜을 최적화 하 고 CreERT2 transgenes 또는 노크 기능 (잭 스Axin2^CreERT2 018867, 및 Sox9^CreERT2 잭 스 018829) 무지개 및 mTmG 시스템 (R26^VT2/GK3, 같은 형광 기자와 함께 R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. 우리 발견 다른 마우스 변종에 대 한이 방법론을 변경할 필요가 없습니다 생존 결과 또는 재생 잠재력에 차이가 관찰 했다.

다른 동물 긴장을 사용 하 여, 우리는 또한 4-hydroxy-tamoxifen 등 5-ethynyl-2-deoxyuridine (듀) 작은 분자 치료 신생아 쥐에 부분 lobular hepatectomies 수행. 옥수수 기름은 사망률의 중요 한 원인 발견으로 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 에탄올 용 매로 사용 되었다. 우리는 그렇지 않으면 작은 분자의 복 관리 생존 또는 재생 결과 미치지 않았다 것을 발견. 우리는이 프로토콜 중생의 다양 한 측면이 다른 작은 분자와 함께 사용 하기 위해 적용할 것 이다 예측.

신생아 마우스 수술 기술적으로 도전적 일 수 있다 고 동물 처리 및 해 부 현미경에서 특별 한 전문성을 요구할 수 있습니다. 축산 전문 산 모 식인 풍습을 방지 해야 하는 수술 하 고 즉각적인 복구 기간 동안.

Protocol

모든 동물 실험 평가 및 인증의 실험실 동물 케어 인터내셔널 (AAALAC) 및 스탠포드 대학 행정 패널 실험실 동물에 대 한 협회에 의해 명시 된 지침에 따라 실시 했다 케어 (APLAC), (프로토콜 번호 #10266) 미국, 또는 유럽 동물 복지 행위, 지침 2010/63/유럽에서. 프로토콜과 정부 바바리아, 독일의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 더 허가 받았다: 55.2-1-54-2532-150-2015. 1. 동물 준?…

Representative Results

그림 1A ( 그림 1B에서 도식), 신생아 부분 lobular hepatectomy의 일반적인 타임 라인과 재생 관찰 될 때까지 대기 하는 시간의 예상된 길이 자세히 설명 합니다. 왼쪽된 엽의 미묘한 재생 관찰된 7-14 일 게시물 수술 수 있습니다. 전체 재생 56 일 게시물 수술 후에 종종 관찰 되었다. 마우스는 수술 후 생리 이상이의 흔적을 표시 합니다….

Discussion

급성 간 상해는 전통적으로 화학 (아 세트 아미노 펜, 에탄올, 사염화 탄소), 또는 외과 모델 (70% 부분 hepatectomy)를 사용 하 여 연구 되었습니다. 재생 반응 후 70% 부분 hepatectomy 글로벌 hepatocyte 비 그리고 세포 분열^4,5의 여러 라운드 특징 되었습니다. 그러나 출혈을 중지 하,이 모델은 제한으로 주요 혈관 재생에 대 한 비정상적인 환경을 떠나 출혈 해야 합?…

Materials

Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors	Vannas	72932-01
5SF Forceps	Dumont	11252-00
Straight Kelly forceps	Grainger	17-050G
Heating pad	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
Rodent Anesthesia System	Kent Scientific	1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri dish	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances	Fisher Scientific	01-912-402
Low Cost Induction Chamber	Kent Scientific	SOMNO-0730