Vi præsenterer her, en ny metode til delvis resektion af leverens venstre lap i neonatal (dag 0) mus. Denne nye protokol er egnet til at studere akut leverskade og skade svar i indstillingen neonatal.
Morfologiske orgel regeneration efter akut væv tab er udbredt blandt lavere hvirveldyr, men er sjældent observeret i pattedyr postnatal liv. Voksen lever regenerering efter 70% delvis hepatectomy resulterer i hepatocyt hypertrofi med nogle replikering i resterende lapper med restaurering af metaboliske aktivitet, men med permanent tab af den skadede lap morfologi og arkitektur. Vi detalje her, en ny kirurgisk metode i den nyfødte, der efterlader en fysiologisk miljø befordrende for regenerering. Denne model indebærer amputation af venstre lap apex og en efterfølgende konservative ledelse regime, og mangler nødvendighed for ligatur af store leveren fartøjer eller kemisk skade, forlader en fysiologisk miljø hvor regeneration kan forekomme. Vi udvider denne protokol til amputationer på juvenile (P7-14) mus, hvor den tilskadekomne leveren overgange fra orgel regeneration til kompenserende vækst af hypertrofi. Præsenteret, korte 30 min-protokollen giver en ramme for at studere mekanismerne af regenerering, sin alder-associerede tilbagegang i pattedyr og karakterisering af formodede hepatisk stilk eller stamfaderen.
Evnen til at regenerere en orgel eller genoprette form og funktion, har været tænkt til at være overvejende tabt over evolutionære tid. Regenerativ potentialet i den voksne pattedyr lever efter akut kemisk eller fysisk skade er blevet fundet for at inddrage mobilisering af alle resterende hepatocytter resulterer i bølger af hypertrofi og par runder af celledeling, hvilket resulterer i en funktionel, men arkitektonisk forskellige orgel1,2,3,4,5. For nylig er begyndt undersøgelser til at karakterisere den regenerativ svar af neonatal pattedyr organer at skade inden for den første uge af livet6,7,8. Disse undersøgelser har vist, at når såret under neonatal udvikling, visse pattedyr organer reagerer med morfologiske regenerering i stedet for kompenserende vækst eller fibrose7,8.
Nylige undersøgelser har vist, at regenerering af både globale struktur og funktion opstår under den tidlige neonatale periode6,7,8. Etablerede leverskade protokoller inddrage kemisk skade eller administration af ethanol9,10,11, acetaminophen12,13,14,15 , tetrachlormethan16,17,18,19, 70% delvis hepatectomy4,20,21, eller fjernelse af venstre og Median fliger. Kemiske administration fører til hepatocyt celledød, men ofte efterlader mikro – og makro-strukturer intakt. Morfologiske regeneration kan ikke let studerede i denne sammenhæng, som den samlede hepatisk arkitektur ikke blev udslettet. 70% delvis hepatectomy indebærer sutur ligatur af de store fartøjer, som er nødvendige til at stoppe blødninger, men efterlader en ikke-fysiologisk miljø med permanent afbrydelse af Vaskulaturen. Desuden, denne metode er kun blevet brugt på voksen gnavere, og dens anvendelse til nyfødte er teknisk meget vanskeligt. Med dette i tankerne, udviklede vi en metode, hvor 20-30% af toppen af den venstre lap er fjernet i en nyfødt P0 mus (figur 1A-1B). Denne metode er kirurgisk konservative, minimalt invasive, ikke teknisk udfordrende, og fører til brutto tab af morfologi uden ligatur af Vaskulaturen, forlader plads til regenerering at forekomme. Den resulterende trinvise protokollen, beskrevet nedenfor, giver mulighed for enhver forsker til at udføre en delvis dråbeformede hepatectomy på neonatal mus for at studere pattedyr neonatal regenerering i de tidlige stadier af postnatal liv. Denne metode har også klart applikationer til sammenlignende studier i regenerativ medicin og stamceller biologi, da det kan bruges i leveren under senere stadier af livet.
De mest almindelige akut leverskade undersøgelser er kemisk induceret skade, voksen lever amputation eller 70% delvis hepatectomy. Kemiske skader ofte involverer intravenøs, intraperitoneal eller oral administration af acetaminophen, tetrachlormethan eller ethanol, og er en forholdsvis nem og ikke-invasiv skade model. Som tidligere diskuteret, kemiske skader resultater i hepatocyt celledød, men ofte blade stroma og parenkym strukturer intakt, hvilket gør det vanskeligt at fremsætte krav om morfologiske regenerering. Kemiske skader centreret ofte om hepatisk fartøjer, hvilket gør det en nyttig teknik til at studere websted og celle-specifikke skade, men gør det også vanskeligt at afhøre, på hele orglet plan, andre populationer, der kan være placeret længere væk fra fartøjer og der kan bidrage til regenerering. På trods af disse begrænsninger stadig kemiske skader en nyttig og meget fysiologisk relevante skade model.
Voksen 70% delvis hepatectomy indebærer fjernelse af de venstre og median lapper efter ligatur af hepatisk Vaskulaturen. Svar til hepatectomy har været godt præget: amputerede leveren 14 dage post 70% delvis hepatectomy udvikler et groft anderledes arkitektur end den oprindelige ubeskadigede lap, som hepatocytter af de resterende højre og spiegelske lapper gennemgå hypertrofi og et par runder af celledeling4,5. Dette gør op tabt masse og funktion, men undlader at regenerere de to amputerede kamre, og derfor erstatter ikke grov morfologi. Skade svar på 70% delvis hepatectomy er nyttige at studere kompenserende vækst mekanismer med begrænset regenerering.
Her, vi fuldt ud at beskrive en protokol for en neonatal delvis dråbeformede hepatectomy. Proceduren indebærer passende animalske udvalg og forberedelse, kirurgiske felt forberedelse, kirurgi og nyttiggørelse. Optimering og tilpasning af hvert af disse trin kan være påkrævet til forskellige applikationer i protokollen.
Vi har grundigt udført og optimeret denne protokol på vildtype C57BL/6J unger (JAX 000664), men for at studere forskellige cellepopulationer og mekanismer for regenerering, vi også brugt forskellige transgene dyr herunder mus husly forskellige Cre og CreERT2 transgener og/eller knock-ins (Axin2CreERT2 JAX 018867, og Sox9CreERT2 JAX 018829) i kombination med fluorescerende reportere, såsom Rainbow og mTmG systemer (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. vi fandt ingen grund til at ændre denne metode for forskellige mus stammer, som ingen forskel i overlevelse resultater eller regenerativ potentiale blev observeret.
Ud over at bruge forskellige animalske stammer, optrådte vi også delvis dråbeformede hepatectomies på neonatal mus behandlet med små molekyler, som 4-hydroxy-tamoxifen og 5-ethynyl-2 ‘-deoxyuridine (EdU). Dimethylsulfoxid (DMSO) og ethanol blev anvendt som opløsningsmidler, da det konstateredes, at majs olie var en væsentlig årsag til morbiditet. Ellers fandt vi, at intraperitoneal indgift af små molekyler ikke påvirkede overlevelse eller regenerativ resultater. Vi forudser, at denne protokol vil blive tilpasset til brug med andre små molekyler til at afhøre forskellige aspekter af regenerering.
Neonatal mus operationer kan være teknisk udfordrende og kan kræve særlig ekspertise i animalsk håndtering og mikroskopiske dissektion. Husdyrhold ekspertise er nødvendig for at undgå maternel kannibalisme efter operationen og under øjeblikkelig restitutionsperioden.
Akut hepatisk skade er traditionelt blevet undersøgt ved hjælp af kemiske (acetaminophen, ethanol, tetrachlormethan), eller kirurgisk modeller (70% delvis hepatectomy). Den regenerative svar efter 70% delvis hepatectomy har været præget for at inddrage globale hepatocyt hypertrofi og flere runder af celledeling4,5. For at stoppe hemorrhaging, er denne model dog begrænset, da de store fartøjer skal være forbundet forlader en unormal miljø for regenerering….
The authors have nothing to disclose.
Vi takker P. Chu til udførelse af H & E og histologi; og C. Wang og A. McCarty til nyttige diskussioner. Forskning blev støttet gennem finansiering fra Virginia og D. K. Ludwig Fund for kræftforskning; National Heart, Lung, og Blood Institute (R01HL058770 og U01HL099999); og California Institute for regenerativ medicin (RC1 00354) tilskud til I.W. Y.R. blev støttet af den Human Frontier Science Program karriere udvikling Award (CDA00017), tyske Research Foundation (RI 2787/1), Siebel stamcelle Institute, og de Thomas og Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. blev støttet af NIH (T32GM007365), den nationale forskning Service Award (1F30DK108561), og Paul og Daisy Soros Fellowship for nye amerikanere.
Animals | |||
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Standard Reagents | |||
Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Standard Equipment | |||
1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |