Her presenterer vi en ny metode for delvis fjerning av den venstre hepatic flik i neonatal (dag 0) mus. Denne nye protokollen er egnet for akutte skader og skader respons i innstillingen neonatal.
Morfologiske organ gjenfødelse etter akutt vev tap er vanlig blant lavere virveldyr, men er sjelden observert i pattedyr postnatal liv. Voksen leveren regenerasjon etter 70% delvis hepatectomy resulterer i hepatocyte hypertrophy med noen replikasjon i gjenværende lobes med restaurering av metabolsk aktivitet, men med permanent tap av skadde lobe morfologi og arkitektur. Her, detalj vi en ny kirurgisk metode i neonate som forlater et fysiologiske miljø bidrar til gjenfødelse. Denne modellen innebærer amputasjon av venstre lobe toppen og en påfølgende konservative behandling diett, og mangler nødvendigheten av ligation av store leveren fartøy eller kjemisk skade, etterlot et fysiologiske miljø der gjenfødelse kan oppstå. Vi utvider denne protokollen til amputasjoner på juvenile (P7-14) mus, som skadet leveren overganger fra organ gjenfødelse kompenserende vekst av hypertrofi. Presentert, korte 30 min protokollen gir et rammeverk for å studere mekanismer for regenerasjon og tilbakegangen alder-assosiert i pattedyr karakterisering av antatte hepatic stammen eller progenitors.
Muligheten til å generere et organ, eller gjenopprette form og funksjon, har vært antatt å være mest tapt over evolusjonær tid. Regenerativ potensialet i voksen pattedyr leveren etter akutt kjemiske eller fysisk skade har blitt funnet for å involvere mobilisering av alle gjenværende hepatocytter bølger av hypertrofi og noen runder av cellen divisjon, noe som resulterer i en funksjonell, men arkitektonisk ulike organ1,2,3,4,5. Studier har nylig begynt å preger regenerativ svaret neonatal pattedyr organer skade innen den første uken av livet6,7,8. Disse studier har vist at når skadet under neonatal utvikling, visse pattedyr organer svare med morfologiske gjenfødelse i stedet for kompenserende vekst eller fibrose7,8.
Nyere studier har vist at regenerering av både globale struktur og funksjon oppstår under de tidlige neonatal tidsriktige6,7,8. Etablerte leverskade protokoller involverer kjemiske skade eller administrasjon av etanol9,10,11, Paracetamol12,13,14,15 , karbon tetrachloride16,17,18,19, 70% delvis hepatectomy4,20,21eller fjerning av venstre og Median lobes. Kjemisk administrasjon fører til hepatocyte celledød, men ofte forlater mikro – og makro-strukturer intakt. Morfologiske gjenfødelse studeres ikke lett i denne sammenheng, som samlet hepatic arkitekturen ikke ble obliterated. 70% delvis hepatectomy innebærer Sutur ligation av de store skipene, som er nødvendig for å stoppe blødningen, men etterlater et ikke-fysiologiske miljø med permanent avbrytelse av blodkar. Videre, denne metoden er bare brukt på voksen gnagere, og sin søknad til nyfødte er teknisk svært vanskelig. Med dette i bakhodet, utviklet vi en metode der 20-30% av toppen av den venstre lobe er fjernet i nyfødte P0 mus (figur 1A-1B). Denne metoden er kirurgisk konservative, minimal invasiv, ikke teknisk utfordrende, og fører til brutto tap av morfologi uten ligation av blodkar, forlater rommet for regenerering oppstår. Den resulterende trinnvise protokollen, beskrevet nedenfor gir noen forsker til å utføre en delvis lobular hepatectomy på neonatal mus for å studere pattedyr neonatal fornyelse i de tidlige stadiene av postnatal liv. Denne metoden har også klart programmer komparative studier i regenerativ medisin og stamcelleforskningen biologi, som det kan brukes i leveren under senere stadier av livet.
De vanligste akutte skader studiene er kjemisk indusert skade, voksen leveren amputasjon eller 70% delvis hepatectomy. Kjemisk skade ofte innebærer intravenøs, intraperitoneal eller muntlig administrasjon av paracetamol, carbon tetrachloride eller etanol, og er en relativt enkel og ikke-invasiv skade modell. Idet tidligere omtalt, kjemisk skade resultater i hepatocyte celledød, men ofte blader stroma og parenchyma strukturer intakt, gjør det vanskelig å gjøre krav om morfologiske gjenfødelse. Kjemisk skade sentre ofte på hepatic fartøyer, gjør det en nyttig teknikk området og celle-spesifikk skade, men gjør det også vanskelig å avhøre, på hele organ nivå, andre befolkninger som kan være plassert lengre fra fartøy og som kan bidra til fornyelse. Til tross for disse begrensningene fortsatt kjemisk skade en nyttig og svært fysiologisk relevant skade modell.
Voksen 70% delvis hepatectomy innebærer fjerning av venstre og median lobes etter ligation av hepatic blodkar. Hepatectomy responsen har vært godt preget: amputert leveren 14 dager innlegget 70% delvis hepatectomy utvikler en grovt forskjellig arkitektur enn den opprinnelige uskadet lobe, som hepatocytter av gjenværende rett og caudate flikene gjennomgå hypertrofi og noen runder av celledeling4,5. Dette utgjør mistet masse og funksjon, men klarer ikke å regenerere to amputert lobes, og derfor erstatte ikke brutto morfologi. Følgelig er skade responsen på 70% delvis hepatectomy nyttig å studere kompenserende vekst mekanismer med begrenset gjenfødelse.
Her beskriver vi fullt en protokoll for en neonatal delvis lobular hepatectomy. Prosedyren innebærer riktig dyr valg og forberedelse, kirurgiske feltet utarbeidelse, kirurgi og gjenoppretting. Optimalisering og tilpasning av hver av disse trinnene kan kreves for ulike programmer av protokollen.
Vi har mye utført og optimalisert denne protokollen på wild type C57BL/6J pups (JAX 000664), men for å studere ulike celle populasjoner og mekanismer for regenerasjon, vi også brukt ulike transgene dyr inkludert mus skjuler ulike grobunn og CreERT2 effekter av transgener og/eller knock-ins (Axin2CreERT2 JAX 018867, og Sox9CreERT2 JAX 018829) i kombinasjon med fluorescerende journalister, som the Rainbow og mTmG systemer (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. vi fant ikke nødvendig å endre denne metodikken for annen mus stammer, som ingen forskjeller i overlevelse resultater eller regenerativ potensial ble observert.
I tillegg til ulike dyr stammer, utført vi også delvis lobular hepatectomies på neonatal mus behandlet med små molekyler, som 4-hydroxy-tamoxifen og 5-ethynyl-2 ‘-deoxyuridine (EdU). Dimethyl sulfoxide (DMSO) og etanol ble brukt løsemidler, som det ble funnet at maisolje var en vesentlig årsak til sykelighet. Ellers fant vi at intraperitoneal administrasjon av små molekyler ikke påvirke overlevelse eller regenerativ utfall. Vi spår at denne protokollen blir tilpasset for bruk med andre små molekyler avhøre ulike aspekter av gjenfødelse.
Neonatal musen operasjoner kan være teknisk utfordrende og kan kreve spesiell kompetanse i dyr håndtering og mikroskopiske disseksjon. Husdyrhold kompetanse er nødvendig for å unngå mors kannibalisme etter operasjonen og i umiddelbar gjenoppretting perioden.
Akutt hepatic skade har tradisjonelt vært studert med kjemiske (Paracetamol, etanol, carbon tetrachloride) eller kirurgisk modeller (70% delvis hepatectomy). Regenerativ svaret etter 70% delvis hepatectomy har vært preget for å involvere globale hepatocyte hypertrofi og flere runder av celledeling4,5. For å stoppe hemorrhaging, men er denne modellen begrenset, som store skipene må være samskrevet forlate en unormal miljø for gjenfødelse. Mange studier har…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker P. Chu for H & E og histology; og C. Wang og A. McCarty for nyttig diskusjoner. Forskning var støttet gjennom finansiering fra Virginia og D. K. Ludwig Fund for forskning; Nasjonale hjerte, lunge og blod Institute (R01HL058770 og U01HL099999); California Institutt for regenerativ medisin (RC1 00354) tilskudd til I.W. Y.R. støttet av den menneskelige Frontier vitenskap Program karriere Development Award (CDA00017), tysk Research Foundation (RI 2787/1), Siebel stamcelleforskningen Institutt, og Thomas og Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. ble støttet av NIH (T32GM007365), National Research Service Award (1F30DK108561), og Paul og Daisy Soros fellesskap for nye amerikanere.
Animals | |||
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Standard Reagents | |||
Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Standard Equipment | |||
1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |