Kısmi Lobular Hepatectomy: Morfolojik karaciğer rejenerasyonu için cerrahi bir Model
Summary
Burada, yenidoğan (0 gün) farelerde karaciğer sol lob kısmi rezeksiyon için yeni bir yöntem mevcut. Bu yeni iletişim kuralı akut karaciğer hasarı ve yaralanma yanıt yenidoğan ortamda çalışmak için uygundur.
Abstract
Morfolojik organ rejenerasyon akut doku kaybı aşağıdaki alt Omurgalılar arasında yaygındır, ama memeli postnatal hayatta nadiren görülmektedir. Yetişkin karaciğer rejenerasyonu % 70 kısmi hepatectomy sonra kalan loblar restorasyon metabolik aktivite, ama kalıcı kaybı yaralı lob’ın Morfoloji ve mimarisi ile bazı çoğaltması ile hepatosit hipertrofisi sonuçları. Burada, fizyolojik bir çevre rejenerasyon için elverişli bırakır kardiyolojik yeni bir cerrahi yöntem ayrıntılı. Bu model sol lob tepe ve bir sonraki muhafazakar yönetimi rejimi amputasyon içerir ve ligasyonu önemli karaciğer damarlarını veya kimyasal yaralanma, nerede rejenerasyon oluşabilir fizyolojik bir ortam bırakmak için gerekliliğini yoksun. Biz bu protokol sırasında yaralı karaciğer tarafından hipertrofisi için telafi edici büyüme organ rejenerasyon geçişler Juvenil (P7-14) fareler üzerinde ampütasyonlar için uzatmak. Sunulmuştur, kısa 30 dk protokolü yeniden oluşturma işlemi, memeliler yılında yaş ilişkili düşüş ve sözde hepatik kök veya ataları karakterizasyonu mekanizmaları incelemek için bir çerçeve sağlar.
Introduction
Bir organ yeniden veya form ve fonksiyon, geri yüklemek için yetenek çoğunlukla evrimsel zamanla kaybolur düşünülmektedir. Yetişkin memeli karaciğer akut kimyasal veya fiziksel yaralanma sonra yeniden üretim potansiyelini hipertrofisi dalgaları ve hücre bölünmesi, işlevsel bir ama kaynaklanan kaç tur sonuçlanan tüm kalan tetkikine seferberlik dahil tespit edilmiştir mimari farklı organ1,2,3,4,5. Son zamanlarda, yaralanma yaşam6,7,8ayının ilk haftası içinde rejeneratif cevaben yenidoğan memeli organların karakterize etmek çalışmalar başladı. Bu çalışmalar yenidoğan geliştirme sırasında yaralı zaman bazı memeli organlar yerine telafi edici büyüme veya fibrozis7,8morfolojik yenilenme ile yanıt göstermiştir.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda genel yapısı ve işlevi rejenerasyon erken neonatal dönem6,7,8sırasında oluştuğunu göstermiştir. Kimyasal yaralanma veya yönetim etanol9,10,11, asetaminofen12,13,14,15 kurulan karaciğer hasarı protokolleri içerir , karbon tetraklorür16,17,18,19, % 70 kısmi hepatectomy4,20,21veya sol kaldırılması ve medyan loblar. Kimyasal yönetim hepatosit hücre ölüme yol açar, ama genellikle mikro ve makro yapıları olduğu gibi bırakır. Genel olarak hepatik mimarisi değil oblitere gibi morfolojik rejenerasyon kolayca bu bağlamda okudu olamaz. % 70 kısmi hepatectomy dikiş tüp ligasyonu kanamayı durdurmak gerekli olan büyük gemilerin içerir ancak fizyolojik olmayan bir çevre damarlara kalıcı bozulma ile bırakır. Ayrıca, bu yöntem yalnızca yetişkin kemirgenler kullanılan ve yenidoğan bebeklerin onun uygulamaya Teknik olarak son derece zordur. Sol lob apeks 20-30 oranında bir yeni doğan P0 fare kaldırıldı bir yöntem bu düşünceyle geliştirdiğimiz (Şekil 1A-1B). Bu yöntem cerrahi olarak muhafazakar, minimal invaziv, teknik olarak zor ve morfoloji damarlara, rejenerasyon gerçekleşmesi için oda bırakarak ligasyonu olmadan kaybı brüt yol açar. Aşağıda açıklanan adım adım iletişim kuralı elde edilen herhangi bir araştırmacı bir kısmi lobular hepatectomy Doğum sonrası yaşam erken dönemlerinde memeli yenidoğan yenilenme eğitim için yenidoğan fareler üzerinde gerçekleştirmek izin verir. Gibi yaşamın daha sonraki evrelerinde karaciğerde kullanılabilmesi için bu yöntem aynı zamanda rejeneratif tıp ve kök hücre biyolojisi, karşılaştırmalı çalışmalar için açık uygulamaları var.
En yaygın akut karaciğer hasarı çalışmalar kimyasal kaynaklı hasar, Yetişkin karaciğer amputasyon veya % 70 kısmi hepatectomy vardır. Kimyasal hasar kez asetaminofen, karbon tetraklorür veya etanol intravenöz mayi veya sözlü yönetim içerir ve nispeten kolay ve non-invaziv yaralanma modelidir. Daha önce tartışılan, kimyasal zarar sonuçlarında hepatosit hücre ölümü, ama sık sık yaprakları stroma ve parankimi yapıları sağlam, morfolojik rejenerasyon hakkında iddiada zorlaştırır. Kimyasal zarar kez Hepatik damarları üzerinde mevcuttur ve hücre özgü yaralanma, eğitim için yararlı bir yöntem yapım merkezleri ancak aynı zamanda bütün organ düzeyinde, gemiler daha fazla–dan yer alan ve bu olabilir diğer nüfus sorgulamaya zorlaştırır yenilenmesine katkıda bulunur. Bu sınırlamaları rağmen kimyasal hasar hala bir fizyolojik açıdan son derece uygun ve faydalı yaralanma model kalır.
Yetişkin % 70 kısmi hepatectomy hepatik damarlara ligasyonu takip sol ve medyan loblar kaldırılmasını içerir. Hepatectomy cevaben de karakterize: uzvunu karaciğer 14 gün sonrası % 70 kısmi hepatectomy kalan sağ ve kaudat lob tetkikine özgün hasarsız lob bundan fena halde farklı bir mimari geliştirir hipertrofisi ve hücre bölünmesi4,5birkaç tur tabi. Bu kayıp kitle ve fonksiyonu, yapar ama iki uzvunu loblar yeniden oluşturmak başarısız olur ve bu nedenle brüt morfoloji yerini almaz. Sonuç olarak, % 70 kısmi hepatectomy yaralanma yanıt telafi edici büyüme mekanizmaları sınırlı yenilenme ile çalışmak yararlıdır.
Burada, tam bir yenidoğan kısmi lobular hepatectomy için bir protokol açıklayın. Uygun hayvan seçimi ve hazırlık, cerrahi alan hazırlık, cerrahi ve kurtarma yordamı içerir. En iyi duruma getirme ve bu adımların her biri uyum Protokolü’nün farklı uygulamalar için gerekli olabilir.
Biz kapsamlı bir şekilde gerçekleştirilen ve bu protokol üzerinde vahşi türü C57BL/6J pups (JAX 000664) en iyi duruma getirilmiş, ancak, farklı hücre popülasyonlarının ve mekanizmaları rejenerasyon çalışmaya, ayrıca çeşitli Cre yataklık fareler de dahil olmak üzere çeşitli transjenik hayvanlar kullanılır ve CreERT2 transgenes ve/veya knock-ins (Axin2CreERT2 JAX 018867, ve Sox9CreERT2 JAX 018829) gibi gökkuşağı ve mTmG sistemleri (R26VT2/GK3, floresan gazetecilere ile birlikte R26 mT/mG) 22 , 23. sağkalım sonuçları ya da yeniden üretim potansiyeli yok farklılıkları tespit edildi gibi farklı fare suşları, bu yöntemi değiştirmek gerek yok bulduk.
Farklı hayvan suşları kullanmaya ek olarak, biz de kısmi lobular hepatectomies 4-hidroksi-Tamoksifen ve 5-ethynyl-2 ‘-deoxyuridine (EdU) gibi küçük moleküller ile tedavi yenidoğan fareler üzerinde yapılır. O Mısır yağı morbidite önemli bir sebebi bulundu gibi dimetil sülfoksit (DMSO) ve etanol solvent kullanılmıştır. Aksi takdirde küçük moleküllerin mayi yönetim hayatta kalma veya rejeneratif sonuç etkilemedi bulduk. Bu iletişim kuralı yeniden oluşturma işlemi, çeşitli açılardan sorguya çekmek için diğer küçük moleküller ile kullanmak için adapte olacağını tahmin ediyorum.
Yenidoğan fare cerrahi teknik olarak zor olabilir ve hayvan işleme ve mikroskobik diseksiyon özel uzmanlık gerektirebilir. Hayvancılık uzmanlığı anne yamyamlık önlemek için gerekli cerrahi ve acil kurtarma süresi boyunca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akut karaciğer hasarı geleneksel kimyasal (asetaminofen, etanol, karbon tetraklorür) ya da cerrahi modelleri (% 70 kısmi hepatectomy) kullanarak çalışılmıştır. Rejeneratif yanıt % 70 kısmi hepatectomy sonra küresel hepatosit hipertrofisi ve hücre bölünmesi4,5birden fazla mermi dahil etmek ile karakterizedir. Büyük damarları rejenerasyon için anormal bir ortam bırakarak bakmaksızın gerekir gibi kanama durdurmak için ancak, bu model sınır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Chu H & E ve histoloji gerçekleştirmek için teşekkür ederiz; ve C. Wang ve A. McCarty yararlı tartışmalar için. Araştırma Virginia ve D. K. Ludwig Fonu kanser araştırma için fon aracılığıyla destek verdi; Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01HL058770 ve U01HL099999); ve California Institute I.W. yr rejeneratif tıp (RC1 00354) hibe için desteklenen insan sınır bilim Program kariyer geliştirme Ödülü ‘ (CDA00017), Alman Araştırma Vakfı (RI 2787/1), Siebel kök hücre Enstitüsü tarafından ve Thomas ve Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. Yeni Amerikalılar için NIH (T32GM007365), Ulusal Araştırma hizmet Ödülü (1F30DK108561), Paul ve Daisy Soros bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a. Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a., Dolak, J. a., Waller, R. L. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
