Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen
Summary
Ein Protokoll wird präsentiert, um bereiten polyvinyl Alkohol-co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit, die mit und ohne Oligopeptide, aufgepfropft wurden, um zu untersuchen, die Wirkung der Steifigkeit von Biomaterialien auf die Differenzierung und Proliferation von Stammzellen. Die Steifigkeit der Hydrogele wurde dadurch die Vernetzung bestimmt.
Abstract
Die Wirkung der körperliche Signale, wie die Steifigkeit der Biomaterialien auf die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen, die von verschiedenen Forschern untersucht worden ist. Jedoch haben die meisten dieser Ermittler Polyacrylamid Hydrogele für Stammzelle-Kultur in ihren Studien verwendet. Ihre Ergebnisse sind daher umstritten, weil diese Ergebnisse von den Besonderheiten der Polyacrylamid und nicht von der physischen Cue (Steifigkeit) von Biomaterialien stammen könnte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Zubereitung von Hydrogele, basieren nicht auf Polyacrylamid, wo verschiedene Stamm, Zellen, einschließlich menschliche embryonale Stammzellen (ES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Zellen gezüchtet werden können. Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit wurden von Bioinert polyvinyl Alkohol-co-Itaconic Säure (P-IA), mit Steifigkeit gesteuert durch Vernetzung Grad ändern Vernetzung Zeit vorbereitet. Die P-IA-Hydrogele veredelt mit und ohne Oligopeptide, die extrazelluläre Matrix abgeleitet wurden als zukünftige Plattform für Stammzelle-Kultur und Differenzierung untersucht. Die Kultur und den Durchgang von amniotische Flüssigkeit Stammzellen, Fettgewebe Stammzellen und humanen ES-Zellen menschlichen iPS-Zellen wird hier ausführlich beschrieben. Die Oligopeptid P-IA-Hydrogele zeigten hervorragende Leistungen, die durch ihre Steifigkeitseigenschaften induziert wurden. Dieses Protokoll berichtet die Synthese von Biomaterial, ihre Oberfläche Manipulation, zusammen mit die Steifigkeitseigenschaften und schließlich, ihre Auswirkungen auf die Stammzellen Schicksal mit Xeno-freie Kulturbedingungen zu kontrollieren. Basierend auf Studien, können solche modifizierten Substraten als zukünftigen Plattformen zu unterstützen und lenken das Schicksal der verschiedenen Stammzellen-Linie zu verschiedenen Verbindungen handeln; und weiter, Regeneration und Wiederherstellung der Funktionen der verlorenen Organs oder Gewebes.
Introduction
Das Schicksal der Stammzelldifferenzierung in einer bestimmten Linie von Zellen und die langfristige Proliferation von Stammzellen, vor allem menschlichen induzierten pluripotenten (iPS) Zellen und menschliche embryonale Stammzellen (ES), ist bekannt durch Inhibitoren, Wachstumsfaktoren, geregelt und / oder kleine bioaktiven Moleküle in Kulturmedien. Vor kurzem wurden die körperliche Signale von Biomaterialien, besonders die Steifigkeit der Zelle Kultur Biomaterialien, anerkannt, ein wichtiger Faktor, der das Schicksal der Stem Cell Proliferation und Differenzierung1,2Führung sein, 3,4,5,6. Daher haben einige Forscher damit begonnen, das Schicksal von Stammzellen, zu untersuchen, die auf Hydrogele auf Differenzierung, kultiviert werden hauptsächlich mit Polyacrylamid Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit.
Die Steifigkeit der Biomaterialien kann fokale Adhäsionen, Zellmorphologie und Zelle Phänotyp Stammzell-Haftung, vor allem in zweidimensionalen (2D) Anbau1,2,3,5steuern. Mechano-sensing Biomaterialien durch Stammzellen wird in der Regel durch fokale Adhäsion Signalisierung über Integrin-Rezeptoren gesteuert. NMMIIA, Nonmuscle Myosin IIA-abhängige Kontraktilität des Zytoskeletts von Aktin spielt eine entscheidende Rolle bei der Mechanosensing der Stammzellen in 2-D-Zelle Anbau-Systeme3,4,5, 7,8,9,10,11.
Engler und seinen Kollegen entwickelte eine interessante Vorstellung, die adulten Stammzellen wie (BMS) Knochenmarksstammzellen auf Zelle Kultur Biomaterialien mit eine ähnliche Steifigkeit der spezifische Gewebe kultiviert in stammt tendenziell aus Zellen zu differenzieren spezifische Gewebe5. BMS-Zellen inkubiert auf 2-D weich Polyacrylamid Hydrogele mit Kollagen Typ I (mit einer Steifigkeit von Hirngewebe vergleichbar) in Erweiterung Medien waren spontan veranlasst, in frühen Neuron Abstammungen zu differenzieren, während auf BMS-Zellen kultiviert beschichtet Hydrogele mit einer Steifigkeit ähnlich dem des Muskels oder kollagenen Knochengewebe erwiesen sich als Differenzierung in frühen Abstammungen der Myozyten und Osteoblasten, jeweils auf 2-D Polyacrylamid Hydrogele3,5induzieren. Viele Forscher haben untersucht, die Stammzell-Schicksal der Differenzierung auf Polyacrylamid kultivierten Hydrogele immobilisiert mit Kollagen Typ I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. es sollte jedoch erwähnt werden, dass einige widersprüchliche1,Berichte18,22,23,24 gibt es für die bekannte Idee vorgeschlagen von Engler Et al. 5 Dies ist weil Engler Idee5 , ausschließlich auf Polyacrylamid Hydrogele entwickelt wurde und ihre Ergebnisse aus bestimmten Merkmalen von Biomaterial (Polyacrylamid) und nicht allein aus der physischen Cue (Steifigkeit) der stammen Das Biomaterial. Daher ist es wichtig, eine andere Art von Hydrogel, zu entwickeln, von denen die Steifigkeit durch Vernetzung der Hydrogele gesteuert werden kann. Zu diesem Zweck wurden Bioinert Hydrogele entwickelt, die waren aus polyvinyl Alkohol-co-Itaconic Säure (P-IA) mit unterschiedlicher Steifigkeit, vorbereitet, die durch den Grad der Vernetzung mit einer veränderten Vernetzung Zeit25, kontrolliert wurde, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. die Stammzellen können auf nonmodified P-IA Hydrogele sowie P-IA Hydrogele mit extrazellulären Matrizen (ECMs) und Oligopeptide veredelt kultiviert werden. In einer früheren Studie25waren humanen hämatopoetischer Stammzellen (hHSCs) aus Nabelschnurblut kultiviert auf P-IA Hydrogele mit verschiedenen Steifigkeiten von 3 kPa bis hin zu 30 kPa-Speicher-Modul wo Fibronektin oder ein Oligopeptid abgeleitet Fibronektin (CS1, EILDVPST) wurde auf der P-IA-Hydrogele gepfropft. Hoher ex-Vivo Falte Ausbau des hHSCs wurde beobachtet, in der P-IA-Hydrogele veredelt mit CS1 oder Fibronektin, die eine mittlere Steifigkeit von 12 kPa bis hin zu 30 kPa25angezeigt.
Menschliche iPS und embryonaler Stammzellen können nicht auf herkömmliche Gewebekultur Polystyrol (TCP) Gerichte33,34 angebaut werden da humanen und iPS-Zellen spezifische Bindung an ECMs, z. B. Vitronectin oder Laminin erfordern weiterhin ihre Pluripotenz während langfristige Kultur. Daher wurden mehrere Strukturen der Oligopeptid gepfropft P-IA Hydrogele mit optimaler Steifigkeit Eigenschaften entworfen und hergestellt in Formationen eine einzelne Kette, eine einzelne Kette mit einem gemeinsamen Segment, eine doppelte Kette mit einem gemeinsamen Segment und eine verzweigte Art Kette-32. Oligopeptid-Sequenzen wurden von Integrin und Glykosaminoglykan-bindende Domänen des ECMs ausgewählt. Die P-IA-Hydrogele, veredelt mit Vitronectin abgeleitet Oligopeptide mit einer doppelten Kette oder gemeinsame Segment, die einen Speicher-Modul auf ca. 25 kPa haben, unterstützt die langfristige Kultur des humanen und iPS-Zellen für über 12 Passagen unter Xeno-frei und chemischen definierten Bedingungen32. Die gemeinsame Segment und doppelte Kette mit Zelle Adhäsionsmoleküle auf die Hydrogele erleichtert die Verbreitung und Pluripotenz menschliche ES und iPS Zellen32. Hier ein Protokoll für die Zubereitung von P-IA Hydrogele (mit einem Speicher Modulus von 10 kPa bis 30 kPa, gemessen unter nassen Bedingungen in der Luft) veredelt mit und ohne Oligopeptide oder ECMs beschrieben. Wird gezeigt, wie man Kultur und passage mehrere Stammzellen (einschließlich amniotische Flüssigkeit Stammzellen, Fettgewebe Stammzellen und humanen ES-Zellen menschlichen iPS-Zellen).
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-OligoECM P-IA-ECM Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit für den langfristigen Ausbau der humanen und iPS-Zellen erhalten ihre Pluripotenz für mehr als zehn Passagen in Xeno-freien Bedingungen sowie für die Kultur der menschlichen AFS, ADS Zellen entstanden, und Blutstammzellen25,28,32. P-IA Hydrogele immobilisiert mit OligoECM sind ein ausgezeichneter Kandidat für Zelle Anbau Materialien zu untersuchen, die Wirkun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde teilweise durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan unter Grantnummern 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 und 104-2221-E-008-107-MY3 unterstützt. Diese Forschung wurde auch durch die Taiwan-Landseed-Krankenhaus-Projekt (NCU-LSH-105-A-001) unterstützt. Eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung (Nummer 15K 06591) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan wird auch anerkannt. A. Higuchi möchte für das International Scientific Partnership Program (Praktizierende-0062) Vizerektorat für Studium und Forschung, König-Saud-Universität, Riyadh 11451, Königreich Saudi-Arabien anerkennen.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
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