腎組織のプライマリ セグメントと新規スキャフォールド フリー構造技術と定款の
Summary
腎構造の組織設計は、臓器不足や透析の有害な影響のためのソリューションを提供します。ここでは、マイクロ プロトコルについて述べるマウス腎臓皮質延髄セグメントの分離を解剖。これらのセグメントは、腎オルガノイドを形成、細胞スキャフォールド フリー構造に注入されます。
Abstract
腎臓移植は末期腎不全の主流療法今です。ただし、順番待ちリストの移植を達成するこれらの患者の 4 分の 1 のみ約 96,000 人に臓器を失敗した人のための代替のため緊急に必要があります。かかる全体的な医療費とともに透析の有害な結果を減らすために活発な調査は臓器移植に代替ソリューションの検索で進行中です。埋込型な組織設計の腎細胞の構成要素は、そのような可能な方法の 1 つ失われた腎機能を置き換えるです。ここでは、マウス腎臓生活髄の隔離のための顕微解剖腎セグメントは、初めて説明しました。これらのセグメントは、一度注入した宿主の血管系と高速接続を可能にするかもしれないスキャフォールド フリー内皮芽構造内で迅速な設立が可能です。成体マウス腎臓腎セグメントの直径 200-300 μ m を取得する万国実体写真レーザーマイクロダイ セクションに続いて、生きているドナーから手に入れられました。のみ 1 つの腎臓から収穫される主な腎のセグメントを使用して複数の腎構造を作製しました。このメソッドは、破棄されますそれ以外の器官から, 腎組織をサルベージできる手順を示します。
Introduction
慢性腎臓病 (CKD) は、現在主要な公衆衛生の課題世界1のいずれかです。アメリカ合衆国における CKD の有病率は苦しんでいる最も深刻な形、末期腎臓病 (ESRD)2600,000 以上のアメリカ人と、総人口の 14% を超えています。現在の透析と腎臓移植腎不全とのそれらに利用できる治療の選択肢。ただし、約 25,000 の患者数は全腎移植です毎年、毎年それらの命を救うオルガンとそれらの受信側の移植3を待っている間に大きな格差につながる患者のかなりの数が追加されます。寿命や生活の質に、深刻な悪影響を及ぼす、に加えて透析は驚異的な財政負担に関連付けられます。2014 年に、メディケアの支払い請求が以上 $ 300 億 ESRD 患者2となりました。限られた臓器供給と透析を必要とする患者のない明白な減少傾向で、透析に代替ソリューションの特定を目的とした研究活動と移植のこれまで重要です。透析の必要性で比較的短い遅延も透析関連コスト4,5,6を延期しながら生産性と品質調整生命年の患者さんの数が大幅に増加します。
腎不全のような機能的な組織の損失のためのソリューションが全臓器工学を使用して足場ベース organoid 作製に至る広く多様なアプローチと組織工学と再生医療研究所を検討中細胞注入7,8,9,10,11の器官構造を脱しました。限界または破棄された腎臓から複雑な腎構造をさただけ部分的に検討されています。実際には、ほぼ腎臓移植のために調達の 20% は様々 な理由から12,13破棄されます。これらの推定の移植から機能性腎組織を活用、1 つまたは多くの組織設計の構成要素に組み込む可能性があります。先行研究では、組織工学の目的14,15に細胞外のマトリックスのため腎臓を利用したこれらの破棄された器官での作業の可能性を実証しました。しかし、いくつかは組織工学目的16,17,18健康な腎臓からプライマリ nephronal 組織を使用しています。
キムらに記載された 1 つの方法は、コンストラクト作製16ポリグ リコール酸 (PGA) 足場で播種し、健康なラットの腎臓から腎「セグメント」分離を含みます。しかし、正確な郭清の方法論に関する少し情報を与え、セグメントが細かいミンチと濾過の組み合わせから得られました。我々 は、同様にそのまま nephronal アーキテクチャにより、個別の腎セグメントが生成されますが、代わりに顕微解剖技術に依存するこのプロトコルの変更について説明します。までは、生きている成体、腎臓、腎被膜を削除すると、組織はさらに解剖、解剖顕微鏡に転送後に実行されます。小口径 30 G 針、切断器具として使用されます、また郭清の支援をガイドとして針として直径腎セグメントのターゲット直径に等しい。分離、この場合マウス、腎のセグメントは文化の実行可能性を維持し、スキャフォールド フリー内皮芽細胞構造19組み込みます。これらの構成要素は以前20バイオ人工膵臓を含む他の臓器をエンジニアに使用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
構造は広く細胞と生体材料の利用、そして多くの場合、両方のタイプに関してそれぞれ異なる生体腎組織をエンジニア リングに使用するメソッドは、古いまたは文献7にない特徴です。多くは幹細胞のアプローチを使用している、または単独で腎のアーキテクチャの個々 のコンポーネントの概説、人工的に細胞懸濁液から以上 26 種類の分化した細胞を臓器全体を再作成の見…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH のポスドク研修制度の助成金、NIH HL 007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016)
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association – European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
