Microdissection av primære nyre vev segmenter og innlemmelse med romanen stillaset-fri konstruksjon teknologi
Summary
Vev-konstruert nyre konstruksjoner tilby en løsning for orgel mangel og skadelige effekter av dialyse. Her beskriver vi en protokoll mikro dissekere murine nyrer for isolering av cortico-medullær segmenter. Disse segmentene er implantert inn stillaset-fri mobilnettet konstruksjoner, danner nyre organoids.
Abstract
Nyre transplantasjon er nå en mainstream terapi for end-stegs nyre sykdom. Men med ca 96 000 mennesker på venteliste og bare en fjerdedel av pasientene oppnå transplantasjon, er det en overmodent for alternativer for de med sviktende organer. For å redusere de skadelige konsekvensene dialyse sammen med totale helsetilbud koster det innebærer, pågår aktive etterforskningen på jakt etter alternative løsninger til organtransplantasjon. Implanterbare vev-konstruert nyre mobilnettet konstruksjoner er en slik mulig tilnærming å erstatte tapt nyre funksjonalitet. Her er beskrives for første gang, microdissection i murine nyrene for isolering av levende corticomedullary nyre segmenter. Disse segmentene er i stand til rask innlemmelse i stillaset-fri endothelial-fibroblast konstruksjoner som kan aktivere rask forbindelse med verten blodkar når implantert. Voksen mus nyrer ble anskaffet fra levende givere, etterfulgt av stereoscope microdissection å få nyre segmenter 200-300 µm i diameter. Flere nyre konstruksjoner ble laget ved hjelp av primære nyre segmenter høstet fra eneste nyre. Denne metoden viser en prosedyre som kunne berge funksjonelle nyre vev av organer som ellers ville bli forkastet.
Introduction
Kronisk nyresykdom (Parallelt) er en av dagens store folkehelsen utfordringer verden1. Utbredelsen av Parallelt i USA er over 14% av befolkningen, med over 600 000 amerikanere lider av den strengeste formen, end-stage renal disease (ESRD)2. De gjeldende behandlingstilbud tilgjengelig for de med ESRD inkluderer dialyse og nyre transplantasjon. Selv om ca 25 000 pasienter gjennomgår nyre transplantasjon hvert år, legges et betydelig antall pasienter årlig fører til et stort misforhold mellom de venter en livreddende orgel og de mottaende transplantasjon3. I tillegg til sin alvorlige negative virkninger på lang levetid og livskvalitet er dialyse forbundet med en forbløffende økonomisk byrde. I 2014 vil summert Medicare betalt krav over $30 milliarder for ESRD pasienter2. Med en begrenset orgel forsyning og ingen tydelig downtrend i pasienter som krever dialyse, forskningsinnsats å identifisere alternative løsninger dialyse og transplantasjon er alltid viktig. Selv en relativt kort forsinkelse i behovet for dialyse øker pasientens antall kvalitet-justert liv år og produktiviteten betydelig samtidig utsette dialyse-relaterte kostnader4,5,6.
Løsninger for funksjonell vev tap, som med ESRD, er for tiden studert i tissue engineering og regenerativ medisin laboratorier, med variert tilnærminger mellom stillaset-baserte organoid fabrikasjon hele organ engineering bruker decellularized orgel strukturer for mobilnettet implantasjon,7,,8,,9,,10,,11. Recapitulating komplekse nyre strukturer fra marginal eller forkastet nyrer har bare delvis blitt undersøkt. Faktisk er nesten 20% av nyrer anskaffet for transplantasjon forkastet for ulike grunner12,13. Funksjonell nyre vev fra disse antatte grafts kan benyttes og innlemmet i én eller flere vev-konstruert konstruksjoner. Tidligere studier har vist muligheten for å arbeide med disse kasserte organer, utnytte nyrer for ekstra-mobile matrisen for tissue engineering formål14,15. Imidlertid har noen brukt primære nephronal vev fra friske nyrer vev-engineering formål16,17,18.
En metode beskrevet tidligere av Kim et al. innebærer isolering av nyre “deler” fra frisk rotte nyrene, som var så frø på polyglycolic syre (PGA) stillaser konstruere fabrikasjon16. Imidlertid lite informasjon er gitt om nøyaktig disseksjon metodikk og segmenter var oppnådd fra en kombinasjon av fine hakking og filtrering. Vi beskriver en endring av denne protokollen, som produserer tilsvarende atskilte nyre segmenter med intakt nephronal arkitektur, men stedet stoler på microdissection teknikker. Nephrectomies utføres på levende voksen mus, hvoretter nyrene overføres til disseksjon mikroskopet der nyre kapselen er fjernet, og vevet er ytterligere dissekert. Små-bar 30½ G nåler brukes som skjærende instrumenter og også som guider hjelpe i disseksjon, som nålen diameter er lik målet diameteren på nyre segmentene. Isolert, i dette tilfellet murine, nyre segmentene opprettholde levedyktighet i kultur og innlemme med stillaset-fri endothelial-fibroblast mobilnettet konstruksjoner19. Disse konstruerer har tidligere blitt brukt til ingeniør andre organer, inkludert en bio-kunstig bukspyttkjertelen20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoder brukt til ingeniør levende nyre vev konstruksjoner varierer med hensyn til både type celler og biologisk materiale benyttes, og i mange tilfeller er foreldet eller ikke godt karakterisert i litteratur7. Mens mange bruker stamcelleforskningen tilnærminger eller recapitulating enkeltkomponenter i nyre arkitekturen i isolasjon, er utsiktene til kunstig gjenskape et hele organ med over 26 forskjellige differensiert celletyper fra mobilnettet suspensjoner overveldende for å vurdere<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH institusjonelle postdoktor trening Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016)
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association – European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
