Foreløpig er immunofluorescent flekker på fast celler metoden for valg for fastsettelse av protein uttrykk nivå når morfologiske informasjonen er også nødvendig. Denne protokollen presenteres her gir en alternativ metode for immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker.
Immunofluorescent flekker er metoden for valg for fastsettelse av protein uttrykk nivå i cellekultur systemer når morfologiske informasjonen er også nødvendig. Protokollen for immunocytochemical flekker på parafin-embedded celleblokker, presenteres her, er et utmerket alternativ for immunofluorescent flekker på ikke-parafin-embedded fast celler. I denne protokollen, en parafin cellen blokk fra HeLa celler ble utarbeidet med metoden thromboplastin-plasma, og immunocytochemistry ble utført for vurdering av to spredning markører, CKAP2 og Ki-67. Kjerner og cytoplasmatiske morfologi av HeLa cellene var godt bevart i cellen blokk lysbildene. På samme tid var CKAP2 og Ki-67 flekker mønstre i immunocytochemistry ganske lik de i immunohistochemical farging i parafin kreft vev. Med endrede cellekultur betingelser, inkludert pre-inkubering HeLa celler under serum-free forhold kunne effekten vurderes samtidig bevare arkitektoniske informasjon. Avslutningsvis er immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker et utmerket alternativ for immunofluorescent flekker.
I de fleste laboratorier brukes parafin-embedded celleblokker vanligvis ikke. Snarere er fast kulturperler celler, ikke parafin-innebygd celler, ansatt i subcellular lokalisering studier. For de faste kulturperler celler, er fluorescens i stedet for chromogen brukt. Derfor er immunofluorescent flekker metoden for valg for fastsettelse av protein uttrykk i forskning ansette celle kulturer1. Lysbilder forberedt immunofluorescent flekker, men kan observeres under immunofluorescent mikroskopi, som kan vise bilder helt annerledes enn angitt under flyet mikroskopi2. I tillegg bevaring av lysbilder til immunofluorescent farging krever beskyttelse fra lys og fluorescerende signaler blir svakere med gjentatt eksponering for bildebehandling på grunn av lysstoffrør signal3. Resultater fra immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker er ganske lik de fra immunohistochemistry på parafin-embedded vev4, og de kan lett oversettes til klinisk informasjon. Immunocytochemistry kan derfor være et utmerket alternativ. Men er cellen-blokk forberedelse ikke populær i grunnleggende forskningslaboratorier. I denne protokollen, deretter er cellen-blokk forberedelse og immunocytochemical flekker forutsatt for å fremme bruk av denne metoden i feltet i celle-kulturstudier.
Celle-blokk forberedelse og immunocytochemistry er ikke unike metoder, og de er allerede utlignet fra klinisk diagnose til grunnleggende forskning4,5. Selv om ulike celle-blokk forberedelse metoder har vært rapportert4,er6 thromboplastin-plasma metoden enkel, kostnadseffektiv og lett tilpasses. Derfor, i protokollen presentert i dette papiret, thromboplastin-plasma metode4,5,6,7,8 brukes for utarbeidelse av parafin-embedded celleblokker.
I studien, ble detaljerte prosedyrer for utarbeidelse av thromboplastin-plasma celleblokker og immunocytochemistry metode ansette to spredning markører vist. En markør er cytoskeleton-assosiert protein 2 (CKAP2), som nylig har blitt rapportert som en mitotisk markør9,10,11; den andre er Ki-67, som er de mest kjente spredning markør12. Representant ordningen er vist i figur 1.
Immunofluorescent flekker på fast kulturperler celler er metoden for valg for fastsettelse av protein uttrykk nivå i cellene samtidig bevare morfologiske informasjon1. Immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker kan imidlertid være et utmerket alternativ. Detaljerte prosedyrer for utarbeidelse av parafin-embedded celleblokker og immunocytochemistry er beskrevet i denne protokollen, og vi håper det kan lette anvendelse av immunocytochemistry i celle studier.
Immunocytochemistry har flere fordeler fremfor immunofluorescent flekker. Immunofluorescent flekk for cellene vanligvis krever fersk kulturperler celler, men parafin celleblokker kan oppbevares ved romtemperatur for flere år13. I tillegg kan immunocytochemistry på celleblokker utforske intracellulær uttrykk mønstre ved hjelp av samme antistoffer i rutinemessige immunohistochemistry på menneskelig vev4. Videre kan det utforske endringene i protein nivå eller posttranslational modifikasjoner enten ved pre rugende celler med ulike stoffer eller under ulike kultur forhold11.
I motsetning til fordelene ved immunocytochemical flekker, utarbeidelse av parafin-embedded celleblokker tar tid og er kostbare14. Også de fleste forskningslaboratorier mangler erfaring i denne teknikken, og tekniske feil under slike omstendigheter er vanlig. De vanligste feilene er dårlig bevaring av celle morfologi og dårlig eller uregelmessig immunocytochemical flekker på parafinsnitt cellen blokk. Disse og de fleste andre kan unngås ved å gjøre celleblokker under beste celle betingelser og bruke nok løsning for å danne celle clots.
Som en demonstrasjon av nåværende protokollen, celleblokker var forberedt HeLa celler, og immunocytochemical flekker ble utført for to spredning markører, CKAP2 og Ki-67, som tidligere rapportert11. Cellene ble manipulert av inkubasjon i media med og uten fosterets bovin serum immunocytochemistry, og effekten av serum sult kunne observeres. Disse forberedt parafin-embedded celleblokker kan brukes til en rekke antistoffer, fordi mange lysbilder kan tilberedes fra en celle blokk med bare en 4-5 µm tykke celle-block delen per lysbilde. Derfor kan uttrykket mønstre tilsvarer to ulike forhold evalueres med flere forskjellige antistoffer. Immunostaining mønstre for CKAP2 Ki-67 i kreft vev allerede har rapportert9,10,11,12og immunocytochemical fargeresultatene kunne lett vurderes, fordi den farging mønstrene var ganske lik de fra immunohistochemistry.
Avslutningsvis kan immunocytochemical flekker på parafin celleblokker være et utmerket alternativ for immunofluorescent flekker; Videre, det kan være enkelt og pålitelig ansatt i grunnleggende forskning for expression profilering i linjer samtidig bevare morfologiske informasjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler til K.-M.H. fra National Cancer Center, Korea (1510121) og National Research Foundation, Korea (nei. NRF-2015R1A2A2A04007432).
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |