Vi beskriver en enkel og enkel protokoll for å måle antistoff avhengige forbedring av infeksjon av Zika virus rekonvalesent serum ved bruk av Dengue virus Reporter viruspartikler.
Antistoff avhengige forbedring av infeksjon har vist seg å spille en viktig rolle i Dengue virus patogenesen. Tradisjonelle analyser som måler kapasiteten i antistoffer eller serum å forbedre infeksjon i utillatelig cellelinjer avhengig med viral produksjon i media etterfulgt av plakk analyser for å kvantifisere infeksjon. Disse analyser har nylig undersøkt Dengue virus (DENV) infeksjon i cellelinjer med fluorescently merket antistoffer. Begge disse metodene har begrensninger som begrenser den utbredte bruken av disse teknikkene. Her beskriver vi en enkel i vitro analysen ved hjelp av Dengue virus reporter virus partikler (RVP’ene) som uttrykker grønne fluorescerende protein og K562 celler å undersøke antistoff avhengige ekstrautstyr (ADE) DENV infeksjon bruker serum som ble Hentet fra rhesus aper 16 uker etter Zika viruset (ZIKV). Denne teknikken er pålitelig, innebærer minimal manipulering av celler, involverer ikke bruk av live replikering kompetent virus og kan utføres i en høy gjennomstrømning format å få en kvantitativ avlesning ved hjelp av flowcytometri. I tillegg kan denne analysen enkelt tilpasses for å undersøke antistoff avhengige forbedring (ADE) av andre flavivirus infeksjoner som gulfeber virus (YFV), japansk Equine Encefalitt virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. hvor RVP’ene er tilgjengelig. Enkel å sette opp analysen, analysere data, og tolke resultatene gjør det svært mottakelig for de fleste laboratorium innstillinger.
Antistoff avhengige ekstrautstyr (ADE) infeksjon er en prosess der delvis cross-reactive antistoff svar indusert av en serotype virus forbedrer opptaket av en annen serotype av viruset, fører til økt viral replikasjon og viremia. ADE har blitt grundig dokumentert i Dengue virus (DENV) infeksjoner der fire store serotyper er utbredt. Et delsett av pasienter er ADE forbundet med denguefeber hemoragisk (DHF). Vi har nylig vist at Zika-smitte (ZIKV) indusert betydelig høye nivåer av DENV cross-reactive antistoff svar som forårsaket ADE av DENV i vitro og trolig bidratt til styrking av DENV viremia i vivo1 , 2. antistoff avhengige ekstrautstyr analyser er et verdifullt verktøy å vurdere kapasitet av antistoffer til å forbedre sekundær infeksjon med i slekt viruser og gi verdifull innsikt i patogenesen av flavivirus infeksjoner og informere den utvikling av vaksiner.
Analysen beskrevet bruker her DENV RVP’ene sammen med K562 celler som er normalt utillatelig til infeksjon. RVP’ene er strukturelt intakt replikering inkompetente DENV virus partikler som kode en sub-genomisk grønne fluorescerende protein (GFP) replicon som uttrykkes etter én enkelt runde med replikering3. Som sådan, celler som blir smittet med RVP’ene fluoresce grønn og kan lett oppdaget flowcytometri eller mikroskopi. RVP’er brukes i denne analysen var oppnådd fra kommersielle kilder. De kan imidlertid være mot andre virus som brukes i analysen beskrevet i dette manuskriptet. I mellomtiden er K562 cellene en FcγIII-reseptor-uttrykke leukemi cellen linje som binder til Fc regionen antistoffer og bli smittet i nærvær av sub nøytralisere konsentrasjoner av antistoff4,5.
ADE analyser har vært mye brukt i studier undersøker risikofaktorer for alvorlig dengue og avgrense mekanismer for i vitro ADE6,7,8. ADE analysen beskrevet her kan raskt og enkelt brukes til å bestemme kapasiteten av serum å forbedre i vitro infeksjon med RVP’ene og flow cytometri, sammenlignet med andre analyser brukes i dag, som krever enten fastsettelse av plakk dannes enheter (pfu) i Vero celler og antistoff farging av infiserte celler6,7,8,9,10,11, begge er tidkrevende og Ap intensiv.
Flaviviruses som DENV og ZIKV dele betydelige bevis for homologi i begge deres strukturelle og ikke-strukturell proteiner som genererer antistoffer som cross-react med hverandre13,14. Disse cross-reactive antistoff svar har vist seg å forbedre infeksjon både i vivo og i vitro en heterologous serotype eller andre relaterte flaviviruses1,2. Potensial til å krysse forbedre infeksjon har …
The authors have nothing to disclose.
Beskrevet prosjektet ble støttet av midler fra Uniformed tjenester Universitetet i helsevitenskap til JJM. Meninger eller påstander heri er privat de av forfatterne, og er ikke skal tolkes som offisielle eller reflekterende synspunktene til Department of Defense, Uniformed tjenester Universitetet i helsevitenskap eller andre byrå i USA Regjeringen.
WGV utført alle eksperimenter og analysert dataene; JJM designet og overvåket studien; WGW og JJM skrev papiret.
DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
RPMI | Corning | 10-040-CV | |
FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |