Denne RNA rullegardin metoden kan identifisere RNA mål for en lenge ikke-koding RNA (lncRNA). Basert på hybridization av hjemmelaget, designet anti-følelse DNA oligonucleotide sonder gjelder for denne lncRNA i riktig fast vev eller cellen linje, kan det effektivt fange av alle RNA målene for lncRNA.
Lenge ikke-koding RNA (lncRNA), som er sekvenser av mer enn 200 nukleotider uten definerte lesing ramme, tilhører den regulatoriske ikke-koding RNAS familie. Selv om deres biologiske funksjoner forblir hovedsakelig ukjent, disse lncRNAs har stadig økt og det anslås nå at mennesker kan ha mer enn 10.000 slik transkripsjoner. Noen av disse er kjent for å være involvert i viktige forskrifter veier av genuttrykk som finner sted på transcriptional nivå, men også i forskjellige trinn av RNA co- og post-transcriptional modning. I sistnevnte tilfeller har RNAs som er rettet av lncRNA identifiseres. Det er derfor det er nyttig å utvikle en metode aktiverer identifisering av RNAs forbundet direkte eller indirekte med en lncRNA rundt.
Denne protokollen, som ble inspirert av tidligere publiserte protokoller slik at isolering av en lncRNA sammen med sine tilknyttede chromatin sekvenser, ble å tillate isolering av tilknyttede RNAs. Vi bestemt at to trinn er avgjørende for effektiviteten av denne protokollen. Først er utformingen av bestemte anti-følelse DNA oligonucleotide sonder kunne hybridize å lncRNA rundt. Dette lncRNA sekundære strukturen var spådd av bioinformatikk og anti-følelse oligonucleotide sonder ble utformet med en sterk affinitet til regioner som viser en lav sannsynlighet for interne base sammenkobling. Andre avgjørende trinn i prosedyren er avhengig av etappe, den stabiliserende forholdene i vev eller kulturperler celler å bevare nettverket mellom alle molekylær partnere. Sammen med høy gjennomstrømning RNA sekvensering, gir denne RNA rullegardin protokollen det hele RNA interactome av en lncRNA av interesse.
Det overordnede målet med metoden beskrevet her er å identifisere RNA molekylær partnere av en lang noncoding (lncRNA). LncRNA tilsvarer sekvenser av mer enn 200 nukleotider uten definerte lesing ramme. Noen av dem har vist seg å være involvert i gene expression regulering, ikke bare på transcriptional nivå, men også i forskjellige trinn av RNA co- og post-transcriptional modning. I sistnevnte tilfeller er molekylære partnere av lncRNA RNAs som identifiseres. En metode aktiverer identifisering av RNAs forbundet direkte eller indirekte med en lncRNA rundt vil deretter være viktig å utvikle.
Tidligere publisert metoder, slik som Chromatin isolasjon av RNA rensing (kvitre)1,2 og fange hybridisering analyse av RNA mål (diagram)3,4, tillater høy gjennomstrømming oppdagelsen av RNA-bundet proteiner og genomisk bindende områder av en bestemt lncRNA. I disse to metodene, lncRNA rundt ble først hybridiserte å biotinylated utfyllende oligonucleotides, og anlegget var så isolert bruker streptavidin perler. Hovedforskjellen mellom disse to teknikker er knyttet til design av sonder som er rettet mot lncRNAs. Kvitre, strategien inspirert av RNA fisk, besto av utforme en pool av kort komplementære DNA oligonucleotide sonder til flis hele lengden av lncRNA. Derimot i DIAGRAMMET tilpasset forfatterne RNase H kartlegging analysen på lncRNAs å undersøke områder tilgjengelig for hybridisering.
Fremgangsmåten foreslått her design anti-følelse DNA biotinylated oligonucleotide sonder bruker bioinformatikk modellering av lncRNA sekundær5 for å velge sonder med en sterk affinitet til regioner som viser en lav sannsynlighet for intern basere sammenkobling. Denne prosedyren har fordelen av å være billigere enn de som er basert på bassenger med fliser oligonucleotide sonder2 og mindre tidkrevende enn de basert på RNAse-H følsomhet4.
Det er en voksende mengde bevis for post-transcriptional gene regulering av lncRNAs6, er det veldig nyttig å utvikle en tilnærming slik at erobringen av RNAs som mål for en lncRNA. Videre skal brukes for de fleste programmer, var tilnærming optimalisert både i kulturperler celler og vev ekstrakter.
Lang noncoding RNAs (lncRNAs) av deres antall og mangfold representerer et stort felt av forskning og de fleste av sine roller er fortsatt å bli oppdaget. Mange av disse lncRNAs har en kjernefysisk lokalisering og blant dem, noen er innblandet i regulatoriske veier av genuttrykk gjennom transcriptional eller posttranscriptional mekanismer. En av de gjeldende utfordringene i dette feltet er å forstå relevansen av de lncRNAs post-transcriptional behandling av RNAs. For dette formålet må RNAs målrettet av lncRNAs identifiseres. Inspirert av tidligere studier fokuserte på sammenslutning av lncRNAs med chromatin, vi utviklet en prosedyre som gjør identifisering av RNAs med en lncRNA. Suksessen til denne protokollen, kalt RNA rullegardinmenyen, er hovedsakelig avhengig to avgjørende skritt, nemlig utformingen av anti-følelse DNA oligonucleotide sonder som måtte spesielt og utelukkende hybridize med lncRNA rundt og forholdene av vev eller cellen fiksering som har å opprettholde dataintegriteten nettverket mellom alle molekylær partnere.
Tidligere publisert protokollene for passordgodkjenning prosedyrer for å isolere et lncRNA sammen med sine tilknyttede chromatin sekvenser (kvitre1,2, diagram3,4). Disse protokollene, var ulike strategier ansatt design anti-følelse DNA biotinylated oligonucleotide sonder. I prosedyren ved å kvitre brukt forfatterne en pool av DNA biotinylated oligonucleotide sonder omfatter hele lengden av lncRNA rundt etter utelukkelse av alle redundante og uspesifikk sonder1,2. I DIAGRAMMET protokollen, forfatterne identifisert områder av lncRNA som er mer tilgjengelig for hybridisering og designet fange oligonucleotides som er rettet mot disse regionene. Disse områdene ble valgt basert på deres RNase-H følsomhet. Faktisk bruker for RNAse-H for å hydrolyze RNAs på nettsteder av RNA-DNA binding, oligonucleotides som hybridize på tilgjengelige områder i lncRNA produsere RNA-DNA hybrider og føre til enzymatisk spalting av lncRNA. Forfatterne valgt tre av disse kandidat fange oligonucleotides og brukte dem i en cocktail3,4.
Prosedyren vi pleide å design anti-følelse DNA biotinylated oligonucleotide sonder var nær som brukes i DIAGRAMMET protokollen, men hybridisering tilgjengelige regionene i den ønskede lncRNA ble ikke valgt basert på deres RNAse-H følsomhet, men Ifølge deres lave sannsynligheten for interne base sammenkobling som bestemmes av bioinformatikk modellering av lncRNA sekundær struktur. Det må være merket at ulike sekundære strukturer vil bli spådd ved hjelp av ulike algoritmer, og sonder velges bør være de som hybridize til tilgjengelig sekvenser av lncRNA i det største antallet sekundære strukturer spådd. De samme resultatene ble oppnådd med enten en cocktail av tre designet, bestemte sonder eller en enkelt sonde individuelt. Dette bedt om bruk av to separate, bestemte sonder og hensynet til positive resultater som de som er felles for disse to sonder. Til slutt, det anbefales derfor begynnelsen av utviklingen av metoden for et optimalt resultat og kunne vurdere spesifisiteten av resultatene av rullegardinmenyen, utforme 3 forskjellige anti-følelse oligonucleotide prober og deretter sammenligne eksperimentelt deres effektivitet, spesielt siden sonden effektivitet kan endres av celle lysate forberedelse. Likevel prosedyren for sonden design basert på bioinformatics modellering av lncRNA sekundær strukturen vi brukte forble billigere enn basert på bassenger med fliser oligonucleotide sonder2, og dette var mindre tidkrevende enn metoden basert på RNAse-H følsomhet4.
En negativ kontroll bør også utføres med som negative fange oligonucleotide enten den forstand DNA biotinylated oligonucleotide sonder eller eggerøre oligonucleotide sonder eller oligonucleotides rettet mot en urelaterte RNA. På grunn av naturlige antisense utskrifter lncRNAs, kan bruk av fornuftig oligonucleotide sonder noen ganger være utilstrekkelig. Uansett oligonucleotide proben valgt for kontrollen negative, er det nødvendig å kontrollere av eksplosjon som det ikke hybridize med en kjent RNA og husk at denne oligonucleotide kan hybridize til en fortsatt un kommenterte lncRNA.
I celle lysates disse RNA rullegardin forsøk ble innhentet fra 106 til 107 celler når du arbeider med kulturperler celler, og fra 1 til 10 mg når du arbeider med vev. Utarbeidelse av celle lysates må tilpasses etter hvilken vev eller cellen brukes to hovedtrinn som må optimaliseres: nemlig cross-linking trinnet som tillater dannelse av kovalente bindinger mellom lncRNA og molekylære partnere, og sonication trinn som reduserer viskositeten av shredding chromatin.
Målet med cross-linking trinnet er å sikre at alle RNA mål forblir lukket for lncRNA ved å indusere dannelsen av et nettverk mellom alle molekylær partnere. En paraformaldehyde behandling trinnet som vil danne kovalente bindinger mellom lncRNA og partnere kan nettverket skal reticulated. I DIAGRAMMET protokollen, ble det foreslått hvis arbeider med kjernefysiske lncRNA, for å utføre en første behandling med paraformaldehyde på hele cellen lysate og en annen behandling på isolerte nukleinsyre brøkdel3,4. Vi observerte at dette supplerende trinnet redusert effektiviteten av sonder, sannsynligvis ved å redusere lncRNA tilgjengelighet i cellene. Dermed graden av reticulation av paraformaldehyde har å tar hensyn til cellen eller vev type brukt, lokalisering av lncRNA rundt, og effektiviteten av designet sonder.
Mens lysing cellene, chromatin er utgitt i den lysate og øker sin viskositet; Det er da nødvendig å makulere chromatin av sonication å øke flyt av prøvene og herav Letter tilgjengeligheten av oligonucleotide sonder til lncRNA av interesse. Sonication vil imidlertid også makulere RNAs utdraget med lncRNA rundt. Det er viktig å minimere sonication tiden slik at mens det effektivt reduserer viskositeten av den lysate, det også tillater obtainment av fragmenter med lengde består mellom 200-800 bp. oppmerksom på at sonication tiden vil være svært avhengig både-antallet og typen vev eller kulturperler celler som brukes.
Avslutningsvis gjør fremgangsmåten beskrevet her på 2-3 dager fangst av RNA mål for en ønsket lncRNA. Sammen med RT-qPCR, kan disse metodene jakt etter en bestemt association og regulering av et mRNA av den ønskede lncRNA som en kandidat. En genomet-bred tilnærming, kan RNA rullegardin eksperimenter analyseres av høy gjennomstrømming RNA-sekvensering tillate henting av alle RNAs knyttet til den ønskede lncRNA. Hva en analytisk strategi, skal RNA rullegardin prosedyren gi nye betydelige kunnskaper om RNA regulering av lncRNAs.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Aix-Marseille-universitetet og CNRS og finansiert av en bevilgning fra Pfizer laboratorier.
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |