Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos
Summary
Det här protokollet beskriver en enkel och bekväm metod för att märka och visualisera levande kromosomer i mitotiska celler med Histone2B-GFP BacMam 2.0 etikett och en snurrande skiva konfokalmikroskopi system.
Abstract
Kromosomer måste vara tillförlitligt och enhetligt uppdelade i dottercellerna under mitotiska celldelningen. Trohet av kromosomala segregation styrs av flera mekanismer som inkluderar den spindel montering Checkpoint (SAC). SAC är en del av ett komplext feedbacksystem som ansvarar för förebyggande av en cell framsteg genom Mitos såvida inte alla kromosomala kinetochores har bifogats till spindel mikrotubuli. Kromosomala släpar och onormal kromosom segregation är en indikator på dysfunktionella cellcykeln kontroll kontrollpunkter och kan användas för att mäta genomisk stabilitet delande celler. Avreglering av SAC kan resultera i att omvandla en normal cell till en elakartad cell genom ansamling av fel under kromosomala segregation. Genomförandet av SAC och bildandet av den komplexa Kinetochor är hårt reglerad av interaktioner mellan kinaser och fosfatas såsom Protein fosfatas 2A (PP2A). Det här protokollet beskriver levande cell avbildning av släpar kromosomer i mus embryonala fibroblaster isolerade från möss som hade en knockout av den reglerande PP2A-B56γ-subenheten. Denna metod övervinner bristerna i andra cellcykeln kontroll avbildningstekniker såsom flödescytometri eller immuncytokemi som endast ger en ögonblicksbild av en cell cytokines status, i stället för en dynamisk spatiotemporal visualisering av kromosomer under Mitos.
Introduction
I följande protokoll beskriver vi en smidig metod för att visualisera kromosomala segregering och mitotiska progression under cellcykeln i mus embryonala fibroblaster använder Histon 2B-GFP, BacMam 2.0 märkning och levande cell imaging.
Cellcykeln kontroll kontrollpunkter övervaka kromosomsegregering och spelar en viktig roll i upprätthållandet av genetisk integritet av cell 1,2,3. Ansamling av mis segregerade kromosomer kan leda till aneuploidi, vilket är ett signum för mest solida tumörer 4. Påvisande av släpar kromosomer kan därför användas som en metod för att studera kromosominstabilitet.
Fluorescently märkt proteiner kan vara används för att visualisera levande kromosomsegregering och kromosomala släpar efter men generationen av mCherry-märkta eller H2B-GFP taggade protein kräver omfattande kunskap om gen leverans och molekylärbiologi 5. Här beskriver vi CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0 reagens, nedan kallad CL-HB regent, för enkelhetens skull. Denna reagens kan användas omedelbart och därmed eliminerar oro vektor kvalitet och integritet. Dessutom kräver denna reagens inte användning av potentiellt skadliga behandlingar eller lipider och dye-lastning kemikalier. Till skillnad från konventionella fluorescerande etiketter, CL-HB regent fläckar oberoende av funktion (dvs., membranpotential). CL-HB regent kan enkelt läggas till cellerna och inkuberas över natten i proteinuttryck. CL-HB regent replikerar inte i däggdjursceller och kan användas i biosäkerhet nivå (BSL) 1 laboratoriemiljö. Också, denna övergående transfection kan upptäckas efter natten inkubation för upp till 5 dagar, tillräckligt med tid för att genomföra mest dynamiska cellulära analyser.
Alternativt kunde kromosomavvikelser studeras av olika tekniker såsom flödescytometri, immunohistokemi eller fluorescens i situ hybridisering (FISH) 6. Flödescytometri kan användas för att studera aneuploidi, som kan mätas utifrån DNA-innehåll och fasen av celler i cellcykeln. Även om flödescytometri kan användas att mäta aneuploidi, ger den inte information om kromosomala felaktig segregation. FISK och immunohistokemi tekniker använda fluorescerande sonder för att binda till DNA eller kromosomer. Medan dessa tekniker ger en ögonblicksbild av status för en population av celler, tillåter de inte levande cell imaging därmed saknas någon information som erhållits genom spatiotemporal visualisering av cytokines i specifika celler följde över en tidsperiod.
Detta protokoll användes för att studera släpar kromosomer eller kromosomala mis segregation i nocodazole behandlade mus embryonala fibroblaster (MEFs) isolerade från PP2A-B56γ-möss. Utöver ovan tillämpning ger detta protokoll ett enkelt verktyg för att märka och visualisera kromosomala segregering i olika celltyper som kan användas för att studera cellcykeln förordning eller kromosomal instabilitet i tumörceller. Det kan dessutom också användas att studera kromosomal instabilitet som orsakas av olika läkemedelsbehandlingar eller studera effekterna av genen knocka resulterar i kromosomala mis segregation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellcykeln kontroll kontrollpunkter som säkerställer korrekt kromosomsegregering förhindra aneuploidi och cell omvandling 1,2,3. I föreliggande studie, fann vi att inaktivering av PP2A-B56γ resulterade i en försvagad spindel montering checkpoint. Levande cellen imaging tillät oss att iaktta kromosomala mis segregation under Mitos i PP2A-B56γ MEFs behandlas med nocodazole 9.
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Guo-Chiuan Hung och Dr Bharatkumar Joshi för värdefulla synpunkter som förbättrat manuskriptet.
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
