체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

요약

이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

초록

체 관 부 및 식물 sap 먹이 곤충 침략 작물과 식량 작물을 손상 하는 과정에서 영양소를 검색 하는 과일의 무결성. Hemipteran 곤충 체 관 부 수액에 먹이로 작물을 손상 하는 식물의 경제적으로 상당한 해충의 숫자에 대 한 계정. 갈색 marmorated 악취 버그 (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae)와 아시아 감귤 류 psyllid (ACP), Diaphorina citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae)는 북미 지역에서 도입 hemipteran 해충 어디 그들은 그들은 실내 집계 때 고부가가치 전문, 행, 및 주식 작물 및 감귤 류 과일의 침략 농업 유해물으로 귀찮은 해충 있습니다. 많은 종에서 살충제 저항 해충 관리 전략의 대체 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이중 가닥 RNA (dsRNA)-중재 RNA 간섭 (RNAi)는 해충의 관리를 위한 공구로 잠재적인 응용 프로그램을 기능 게놈 연구에 대 한 메커니즘을 입을 유전자. 것 합성된 dsRNA 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)은 동종 제시 하는 내 생 RNA의 저하를 통해 매우 효율적인 유전자 침묵 하는 것을 실행할 수 있습니다. 효과적이 고 환경으로 사용 RNAi 분자 biopesticides biocontrol hemipteran 곤충의 대 한 먹이 통해 dsRNAs 비보에 전달을 해야합니다. 여기 곤충 dsRNA의 납품을 위한 방법 제시: 침수로 녹색 콩으로 dsRNA의 로드 하 고 섭취를 통해 구두 전달 유전자 특정 dsRNA의 흡수. 우리는 또한 비-유전자 변형 식물 배달 방법을 사용 하 여 잎 스프레이, 루트 물 약, 트렁크 주사 뿐만 아니라 찰 흙과 립, 모두의 dsRNA의 지속적인된 출시에 필수적인 수 있습니다 설명 했습니다. 구두로 섭취 dsRNA에 의해 효율적인 배달 타겟된 유전자, 청소년 호르몬 산 O-methyltransferase 등 (JHAMT)와 vitellogenin (Vg)의 표현에 상당한 감소를 유도 하는 효과적인 복용량으로 확인 됐다. 이러한 혁신적인 방법 해충 관리에 대 한 환경 문제를 극복 하 고 작물 보호에 사용 하는 dsRNA의 납품에 대 한 전략을 나타냅니다.

서론

Hemipteran 곤충 높은 인구 증가 달성 하 여 식물에 질병을 확산 그들의 능력의 agriculturebecause의 경제적으로 가장 중요 한 해충의 일부를 구성. BMSB, H. halys 찾을, 1996¹에 보고 된 첫 번째 보이 질와 아시아 (중국, 대만, 한국, 그리고 일본)에서 알 렌 타운, 펜실베이니아에 서반구에 실수로 도입 된 침입 해충 이다. 그것의 소개부터 BMSB Mid-atlantic (DE, MD, 펜 실바 니 아, 뉴저지, 버지니아, 그리고 웨스트 버지니아), 뿐만 아니라 캐나다, 유럽, 가장 높은 인구가 43 개 주에서 감지 되었습니다 하 고 농업²에 잠재적인 위협을 나타냅니다. Polyphagous 해충으로 BMSB 사과, 포도, 관 상용 식물, 씨앗, 콩, 작물과 옥수수 등 고부가가치 작물을 포함 하 여 약 300 확인 된 식물 호스트 손상을 선동 수 있습니다. 피해는 어디 동물 피어 호스트 작물 영양분을 혈관 조직^2,3에서 액세스 하는 바늘 같은 stylet와 lacerate 및 플러시 라고 먹이의 모드 때문에 주로 발생 합니다. BMSB 학교 등 생활....

프로토콜

1. BMSB 양육

1. 표준 실험실 연습와 앞에서 설명한⁶³BMSB 곤충 후면.
2. 유리 공장 (22 ° C) 및 자연 채광에 감귤 꽃 에 ACP (D. citri) 곤충을 올립니다. 성인 ACP를 사용 하 여, 대략 5-7 일에 게시 일수로.

2. 유전자 영역 및 체 외에서 합성 dsRNA의 선택

1. 이전에 게시 transcriptome 프로필³²에서 BMSB에 특정 유전자를 선택 합니다.
2. 200 ~ 500의 기본적인 쌍 사이 다를 선택 하는 관심 영역을 확인 합니다.
3. 연쇄 반응 (PCR) genomic DNA에서 선택 된 유전자와 관련 된 파편을 생성 하기 위해 아래 설명 된 조건을 사용 하 여 수행 합니다. 유전자 관련 oligonucleotides 표 1 을 참조 하십시오.
   1. PCR 반응: 0.25 mL PCR 튜브에 결합 PCR 버퍼, dNTP 혼합물 (2.5 m m 각)의 4 µ L, 2 µ L의 DNA 템플렛 (50 ng / µ L), 2.5 µ L 각 뇌관 1과 2 ....

결과

BMSB 4^회 탈피 님프에 먹이 통해 야채 중재 dsRNA 배달 분자 biopesticides RNAi를 사용 하 여 침입 곤충 해충에 대 한 개발에 대 한 테스트를 했다. BMSBs 피드로 알려진 메커니즘에 의해 그들의 바늘 같은 stylets를 사용 하 여 입힌 고 플 러쉬, 어떤 작물에 상당한 손상을 초래. 슬림 유기 녹색 콩, P. vulgaris L., 영양소 또는 dsRNA 전달 될 수 있는 비보에 BMSB에 먹이³테스트에 사용 되었다. 녹두의 세그먼트는 DNase/RNase 무료 물 또는 물과 녹색 식용 색소 BMSB (그림 1A)에서 배달 테스트 솔루션에 몰두 했다. 녹색 식용 색소는 dsRNA를 모방 하는 시각적 표시로 사용 되었다. 녹색 콩의 혈관 조직 모 세관 작용⁶²

토론

RNAi 입증 유전자 생물학 기능 및 규정, 해충^19,,6869,70, 의 관리에 대 한 활용을 중대 한 잠재력을 탐험을 위한 중요 한 도구 ⁷¹. 디자인 및 특정 곤충 종과 곤충에 해당 dsRNA(s)의 납품의 방법에 입을 위한 적절 한 gene(s)의 선택은 매우 중요 둘 다. 곤충으로 dsRNA를 제공 하기 위한 최적의 방법이 결정 되어야 합니다 경험, 배달에 대 한 상대적인 복용량 선택 함께 이점 및 기타 제한 특정 방법을 제공할 수 있습니다. 궁극적으로 환경 방출에 대 한 적합 한 수 있습니다 분자 중국의 개발, 실현, 효율적이 고 유리한 전달 방법이 필요 합니다. 예를 들어 몸에 붙이기도 적용된 dsRNA 곤충 컨트롤을 감귤 류와.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BMSB (H. halys) 곤충	USDA
ACP (D. citri) 곤충	USDA
유기농 녹두	N/A
시트러스 식물	USDA
차아염소산나트륨 용액	J.T. 베이커
녹색 식용 색소	McCormick & Co., Inc
써모 포마 챔버	Thermo Fisher Scientific
마젠타 용기(배양)	시그마
프라이머	IDT DNA
SensiMix SYBR	Bioline
qPCR ABI 7500	응용 바이오시스템
스프레이 병	N/A
Parafilm	American Can Company
TaKaRa Ex Taq	Clontech
QIAquick	Qiagen