高频超声监测小鼠瘀血致深静脉血栓形成

Summary

本议定书描述了使用停滞模型获得静脉血栓的步骤。此外, 我们使用非侵入性的方法来测量血栓形成和解决的时间。

Abstract

静脉血栓是一个常见的情况, 影响 1-2% 的人口, 每年发病率为1在500。静脉血栓形成可能导致死亡通过肺栓塞或导致后血栓综合征, 特点是慢性腿部疼痛, 肿胀, 溃疡, 或慢性肺动脉高压导致严重的慢性呼吸道妥协。这是最常见的心血管疾病后心肌梗塞和缺血性中风, 是一个临床挑战, 所有医学学科, 因为它可能会复杂化的过程中其他疾病, 如癌症, 系统性疾病, 外科手术, 和重大创伤。

实验模型是研究这些机制的必要条件。停滞模型诱导的血栓大小和可量化的血栓的数量。然而, 有必要系统地结扎下腔静脉的侧支, 以避免血栓大小的变异性和任何错误的数据解释。我们已经开发了一种非侵入性的方法来测量血栓的大小, 使用超声检查。使用这种技术, 我们可以评估血栓的发展和解决时间在同一动物。这种方法限制了量化静脉血栓所需的小鼠数量, 这符合研究中动物的替换、还原和细化的原则。我们已经证明血栓的重量和血栓大小的组织学分析与超声测量结果相关。因此, 本研究介绍了如何利用下腔静脉瘀模型诱导小鼠深静脉血栓形成, 以及如何利用高频超声对其进行监测。

Introduction

静脉血栓栓塞 (职教) 由深静脉血栓 (DVT) 和肺动脉栓塞组成, 是心肌梗死和中风后心血管死亡的第三大主要原因。这是一个常见的情况, 影响 1-2% 的人口, 每年发病率1在 500¹。职业教育可导致: 1) 肺栓塞死亡;2) 血栓后综合征, 以慢性腿部疼痛、肿胀和溃疡为特征;或 3) 慢性肺动脉高压导致严重的慢性呼吸道损害。职业教育是一种多因素疾病, 可能是由于血流停滞、血管壁损伤和/或高凝状态造成的, 因为凝血和纤溶系统之间的平衡紊乱, 正如100年前所描述的那样。被 Virchow, 被称为 Virchow 的黑社会。

因为在大多数情况下, 不可能获得人类 dvt 样本, 研究人员已经开发了实验动物模型的 dvt。包括老鼠²、鼠标³、兔子⁴、猪⁵、狗⁶和非人类灵长类⁷在内的几种动物已被使用。小鼠可以进行基因修饰, 是最常用的研究 DVT 的动物。然而, 像在所有的动物, 自发性 DVT 是没有观察到的小鼠。因此, 血管壁的物理或化学改变是用来产生血栓的小鼠。我们以前使用氯化铁模型诱导小鼠下腔静脉血栓形成

Protocol

所有程序均获加拿大麦吉尔大学蒙特利尔的机构动物护理委员会批准。所需设备全部列于表一。

1. 小鼠 (C57BL/6J) 静脉瘀血协议

1. 手术准备
   注意: 这是一种生存手术, 因此, 需要在任何时候都遵循适当的无菌技术。这包括确保所有材料都在手边, 清洁和消毒仪器在使用之前和之间, 并指定一个不育的区域在工作表面上的所有无菌材料。
   1. 用高压釜消毒所有外科器械和材料。一个玻璃珠灭菌器足以在动物之间消毒仪器提示, 如果不止一个程序正在进行一次。
   2. 麻醉 8-10 周老 C57Bl/6 雄性小鼠, 混合100% 氧和2.5% 异氟醚。
      注: 根据需要调整氧气和异氟醚的流量。
   3. 通过捏紧脚趾与镊子之间的动物的后爪来确认麻醉。没有反应从捏表明动物被麻醉。
   4. 通过皮下注射治疗缓释镇痛 (丁丙诺啡)。给老鼠1毫克的止痛药, 每1公斤体重 (1 毫克/千克)。
   5. 将眼膏放在动物的两只眼睛上, 以确保手术期间没有角膜干燥。
   6. 管理 0.2-0.5 毫升的等位流体每10克的体重皮下。
   7. 用手术胶带把动物固定在手术桌上。将动物置于仰卧位以露出腹部。在加热垫上做手术以防止体温过低。
   8. 使用 1-2 分钟的脱毛膏去除老鼠腹部的毛发. 如有必要, 用纱布和蒸馏水擦拭腹部清洁。
   ....

Results

瘀静脉血栓形成模型

在停滞模型中, 小鼠被麻醉, 并进行切口以暴露下腔静脉。切口是在鼠标的左侧或右侧进行, 而不是用不干扰超声探头的方式进行中线剖腹手术。腹部肌肉和皮肤被折叠以暴露出静脉 (图 1)。首先, 侧枝用6-0 丝缝线结扎 (图 2)。然后, 通过钝夹层将静脉与主动脉分离, 将丝放在静脉内 (图 3A-c)。静脉结扎6-0 丝缝合。在结扎部位下面的静脉扩张是成功阻断血流的征兆 (图 3D)。最后, 腹膜腔和皮肤以连续的方式缝合 (图 3E)。

Discussion

使用瘀模型对成功的静脉血栓形成有几个关键步骤。由于下腔静脉和主动脉周围脂肪积聚, 导致静脉血栓形成对老鼠更具挑战性。理想情况下, 正在进行此手术的老鼠应该是 8-10 周大。在钝性解剖和结扎过程中, 应注意不要诱发静脉内皮损伤。此外, 在手术后至少30分钟内将动物保存在34摄氏度的孵化器中是至关重要的, 只有在完全康复后才能将其归还给其他动物的公司。当手术做得正确时, 动物在术后护理中表现得非常好。他们没有表现出严重的副作用, 如跛行, 麻痹, 或尿失禁。手术后, 他们可能会表现出运动的减少和略有驼背的姿势, 但只要镇痛有效, 手术正常, 就不会出现这种情况。

停滞模型产生一个大的血栓与可重复的大小测量从一只老鼠到另一个。与人类一样, 静脉系统的解剖在小鼠之间变化, 最近在静脉血栓形成的狭窄和瘀阻模型中, 已经讨论了血管内分支中断的问题^13,14。勃兰特et表明, 当侧支分支位于静脉结扎部位 < 1.5 毫米处时, 阻止了由流动限制引起的血栓形成。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 永久手工丝线缝合	Ethicon	706G
手术剪刀	Fine Science Tools	20830-00
缝合打结钳	Fine Science Tools	20830-00
钝镊子（直和弯曲）	Fine Science Tools	20830-00
针头驱动	Fine Science Tools	13002-10
Moria Spring Scissors	Fine Science Tools	15396-00
1ml 注射器	BD Biosciences
26G 针头	Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 高分辨率成像系统	Visualsonics	不再出售
SR 丁丙诺啡	ZooPharm		通过兽医手术显微镜给予 LDI
	徕卡	Leica M651
Systan 眼药膏	Alcon	288/28062-0
2x2 无菌纱布	CDMV	#104148
棉尖			JGH
Transpore 低过敏性手术胶带	CDMV	#7411
超声凝胶 （Aquasonic-100）	Dufort &Lavigne #AKEN4061
JGH 的培养箱
氟烷	Dispomed
麻醉室、软管和管理设备	Dispomed
脱毛器	Nair
Water 加热硬垫	Braintree Scientific， Inc.	#HHP-2
Gaymar 加热器水泵 TP500	MATVET Inc.	#R-500305
红外加热灯	electrimat inc.	#1R175R-PAR
小鼠直肠温度 prope	emkaTECHNOLOGIES
JGH	的无菌水