Et Protein Microarray analyse for serologisk bestemmelse af Antigen-specifikke antistof reaktioner følgende Clostridium difficile infektion

Summary

I denne artikel beskrives en simpel protein microarray metode til profilering LUN immun svar til en 7-plex panel af meget renset Clostridium difficile antigener i menneskelige sera. Protokollen kan udvides til bestemmelse af specifikt antistof reaktioner i forberedelserne af polyklonale intravenøs immunglobulin.

Abstract

Vi giver en detaljeret oversigt over en roman høj overførselshastighed protein microarray analyse til bestemmelse af anti –Clostridium difficile antistof niveauer i menneskers sera og separat præparater af polyklonale intravenøs immunglobulin (IVIg). Protokollen beskriver de metodiske trin involveret i prøveforberedelse, udskrivning af arrays, analyseprocedure og dataanalyse. Derudover kunne denne protokol udvikles yderligere for at integrere forskellige kliniske prøver herunder plasma og celle kultur analysere. Vi viser, hvordan protein microarray kan bruges til at afgøre en kombination af isotype (IgG, IgA, IgM), underklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), og stamme-specifikke antistoffer mod meget renset hele C. difficile toksiner A og B (toxinotype 0, stamme VPI 10463, ribotype 087), toksin B fra en C. difficile toksin B kun udtrykke stamme (CCUG 20309), en forløber form af et B fragment af binære toksin, pCDTb, ribotype-specifikke hele overflade lag proteiner (SLPs, 001, 002, 027), og kontrollere proteiner (stivkrampe toxoid og Candida albicans). Under eksperimentet, microarrays er aftestede med sera fra personer med C. difficile infektion (CDI), personer med cystisk fibrose (CF) uden diarré, raske kontrolpersoner (HC), og fra enkeltpersoner pre og post-IVIg behandling for den behandling af CDI, kombineret immundefekt sygdom og kronisk inflammatorisk demyeliniserende polyradiculopathy. Vi møder betydelige forskelle i toksin neutralisering efficacies og multi-isotypen specifikt antistof niveauer mellem patientgrupper, kommercielle præparater af IVIg, og sera før og følgende IVIg administration. Også, der er en markant sammenhæng mellem microarray og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) for antitoksin IgG niveauer i serumprøver. Disse resultater tyder på, at microarray kunne blive et lovende redskab for profilering antistof svar til C.difficile antigener på vaccineret eller inficerede mennesker. Med yderligere finjustering af antigen paneler og en reduktion af produktionsomkostningerne forventer vi, at microarray teknologi kan hjælpe med at optimere og vælge de mest klinisk nyttige immunoterapi til C. difficile infektion på en patient-specifikke måde.

Introduction

Denne protokol beskriver udvikling og validering af en roman og tilpassede protein microarray analyse til påvisning og semi-kvantificering af bakteriel stamme og isotypespecifikke antistof svar til C. difficile antigener. Vi kunne bruge vores C. difficile-specifikke microarray analyse som en lovende nye værktøj til den kompositoriske bioanalyse af specifikt antistof indhold i patientens sera^1,2, præparater af IVIg³, og identifikation af antistof særtræk, der korrelerer med dårlige resultater i CDI⁴. Vi demonstrere, hvordan biobanked serumprøver og kommercielle præparater af IVIg kan analyseres på microarray dias, så høj kvalitet reproducerbare profilering af C. difficile patogen-specifikke antistof svar i denne analyse.

Mange raske børn og voksne har påviselige serum IgG og IgA antistoffer til C. difficile toksiner A og B^5,6. Disse menes at opstå efter forbigående eksponering under vorden og efter udsættelse for C. difficile i voksenalderen. Derfor polyklonale IVIg har været brugt off-label til behandling af tilbagevendende og fulminant CDI^7,8,9. Men dens endelige rolle og virkningsmekanisme er fortsat uklart. Flere undersøgelser har vist, at den LUN immun svar til C. difficile toksiner spiller en rolle i sygdom præsentation og resultatet. Specifikt, viser asymptomatiske patienter en øget serum anti-toksin A IgG koncentration sammenlignet med patienter, der udvikler symptomatisk sygdommen¹⁰. En påviselig tilknytning er blevet rapporteret til median anti-toksin A IgG titers og 30-dages all-dødelighed¹¹. Flere rapporter har også afsløret en forening med en beskyttelse mod gentagelse og antistof svar til toksin A, B og flere ikke-toksin antigener (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD og overflade lag proteiner (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. disse observationer har ansporet udvikling af den første passiv immunterapi narkotika målretning C. difficile toksin B (bezlotuxumab), som er for nylig blevet godkendt af US Food and Drug Administration og det Europæiske Lægemiddelagentur Agentur for forebyggelse af tilbagevendende CDI¹⁶. Vaccinationsstrategier ved hjælp af inaktiverede toksiner eller rekombinant toksin fragmenter er også i øjeblikket under udvikling^17,18,19. Disse nye terapeutiske tilgange vil utvivlsomt fremme kravet om evaluering LUN immun svar til flere antigener i store stikprøvestørrelser.

I dag, er der en bemærkelsesværdig mangel på kommercielt tilgængelige høj overførselshastighed assays i stand til samtidigt vurdere bakteriel stamme og isotypespecifikke antistof svar til C. difficile antigener. Der er et udækket behov for at udvikle sådanne assays for at lette fremtidig forskning og kliniske applikationer. Protein microarrays er en metode til at immobilisere stort antal individuelt renset proteiner som et rumligt organiseret vifte af steder på en mikroskopisk slide-baserede overflade ved hjælp af en robot system, som kan være enten en kontakt²⁰ eller en ikke-kontakt udskrivning værktøj²¹. Steder kan repræsentere komplekse blandinger som cellelysater, antistoffer, væv homogeniseret, endogene eller rekombinante proteiner eller peptider, kropsvæsker eller narkotika^22,23.

Protein microarray teknologi tilbyder forskellige fordele i forhold til standard in-house ELISA teknikker, som traditionelt er blevet brugt til at vurdere anti –C. difficile antistof reaktioner. Disse omfatter en øget kapacitet til at afsløre et udvalg af multi-isotypespecifikke antistoffer mod en mere omfattende panel af protein mål, reduceret volumen krav for antigener, prøver og reagenser, og en forbedret evne til at indarbejde en større antallet af tekniske replikater, foruden flere interne kvalitetskontrol (QC) foranstaltninger¹. Microarrays er derfor mere følsomme, nøjagtige og reproducerbare og har et større dynamikområde. Disse faktorer gør microarrays en billigere og potentielt gunstige alternativ til ringprøver for storstilet påvisning af kendte proteiner. Imidlertid ulemper af microarray teknologi skyldes hovedsageligt store up-front udgifter i forbindelse med oprettelse af et panel af højtrenset antigener og oprette den teknologiske platform.

Protein microarrays har været flittigt brugt i de seneste to årtier som et diagnostisk og grundlæggende forskningsværktøj i kliniske applikationer. Specifikke anvendelser omfatter protein udtryk profilering, undersøgelse af enzym-substrat relationer, biomarkør screening, analyse af host-mikrobe interaktioner, og profilering antistof specificitet^{23,24, 25,26,27,28}. Mange nye patogen protein/antigen microarrays er fastlagt, herunder malaria (Plasmodium)²⁹, HIV-1³⁰, influenza³¹, alvorlig akut luftvejssyndrom (SARS)³², viral hæmoragisk feber³³ , herpesvirus³⁴, og tuberkulose³⁵.

Denne protokol vedrører oprettelsen af en let drift C. difficile reaktive antigen microarray analyse, som muliggør præcis, præcis og specifik kvantificering af multi-isotypen og stamme-specifikke antistof svar til C. difficile antigener i sera og polyklonale IVIg. Heri, medtager vi repræsentative resultater vedrørende en acceptabel microarray analyse ydeevne i forhold til ELISA assay præcision og reproducerbarhed profiler. Denne analyse kunne udvikles yderligere for at profilere andre kliniske prøver og sætter en ny standard for forskning i den molekylære grundlag af CDI.

Protocol

1. udarbejde en Microarray plade Fortynd C. difficile antigener med en udskrivning buffer [PBS-Tween-trehalose (50 mM)] i den optimale koncentration, (som var foruddefinerede før du kører de patient sera): toksin en (200 µg/mL) og toksin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), og renset indfødte hele SLPs stammer fra ribotypes 001, 002 og 027 (200 µg/mL).Bemærk: Toksin B blev indhentet fra et toksin B-udtrykker stamme CCUG 20309 (90 µg/mL). Fortynd de positive kontroller, lysates af …

Representative Results

Figur 1 illustrerer et rutediagram, der beskriver de vigtigste trin i den beskrevne protokol. Figur 2 viser Spearman korrelation tests viser betydelig aftale mellem microarray og ELISA for IgG og IgA anti-toksin A og B niveauer i patient testsera. Figur 3 viser differential IgG og IgA antistof-klasse specifikt antistof svar til toksin A, toksin B og binære toksin (pCDTb) i patienter med CF uden diar…

Discussion

I denne protokol, har vi vist, at microarray er en velegnet platform til at definere humorale immunrespons til C. difficile protein antigener i patient sera (tallene 3 og 6) og kommercielle præparater af IVIg (figur 5). Vi har også bevist at microarray teknik udfører godt i forhold til konventionelle ELISA (figur 2) og viser fremragende reproducerbarhed, med intra og Inter-Diesel assay variabilitet falder inden for a…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A