En Protein Microarray analys för serologisk bestämning av Antigen-specifika antikroppen Svaren följande Clostridium difficile infektion

Summary

Denna artikel beskriver en enkel protein microarray metod för profilering humorala immunsvar mot en 7-plex panel av mycket renad Clostridium difficile antigener i humant serum. Protokollet kan förlängas för bestämning av specifika antikroppen svaren i förberedelserna av polyklonala intravenöst immunglobulin.

Abstract

Vi ger en detaljerad översikt över en roman hög genomströmning protein microarray analys för bestämning av anti –Clostridium difficile antikroppsnivåer i Humansera och i separata beredningar av polyklonala intravenöst immunglobulin (IVIg). Protokollet beskrivs de metodologiska steg som ingår i provberedning, utskrift av matriser, analysförfarande och dataanalys. Detta protokoll kan dessutom utvecklas ytterligare för att införliva olika kliniska prover inklusive plasma och cell cellkulturer. Vi visar hur protein microarray kan användas för att bestämma en kombination av isotyp (IgG, IgA, IgM), underklass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) och stam-specifika antikroppar mot höggradigt renat hela C. difficile toxiner A och B (toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotyp 087), toxin B från en C. difficile toxin-B-only uttrycker stam (CCUG 20309), en föregångare form av ett B fragment av binära toxin, pCDTb, ribotyp-specifika hela ytskiktet proteiner (SLPs; 001, 002, 027), och styra proteiner (stelkramp tetanustoxoid och Candida albicans). Under experimentet, microarrays är utforskad med sera från individer med C. difficile -infektion (CDI), personer med cystisk fibros (CF) utan diarré, friska kontroller (HC), och från enskilda pre- och post-IVIg-terapi för den behandling av CDI, kombinerad immunbrist sjukdom och kronisk inflammatorisk demyeliniserande polyradiculopathy. Vi möter betydande skillnader i toxin neutralisering efficacies och multi-isotyp specifika antikroppsnivåer mellan patientgrupper, kommersiella beredningar av IVIg, och sera före och efter IVIg-administrering. Dessutom finns det en signifikant korrelation mellan microarray och enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för antitoxin IgG-nivåer i serumprover. Dessa resultat tyder på att microarray skulle kunna bli ett lovande verktyg för profilering antikroppssvaret mot C.difficile antigener hos vaccinerade eller infekterade människor. Med ytterligare förfining av antigen paneler och en minskning av produktionskostnaderna, räknar vi med att Mikroarrayteknik kan hjälpa optimera, och välj de mest kliniskt användbar immunterapier för C. difficile infektion i ett patient-specifika sätt.

Introduction

Det här protokollet beskriver utveckling och validering av en roman och anpassade protein microarray analys för detektion och semi kvantifiering av bakteriell stam och isotyp-specifika antikroppssvaret mot C. difficile antigener. Vi använder framgångsrikt våra C. difficile-specifika microarray analys som ett lovande nytt verktyg för den kompositionella bioanalys av specifika antikroppen innehåll i patientsera^1,2, beredningar av IVIg³, och identifiering av antikropp särdrag som korrelerar med dålig utfall i CDI⁴. Vi visar hur biobanked serumprover och kommersiella preparat av IVIg kan analyseras på microarray diabilder, möjliggör hög kvalitet reproducerbara profilering av C. difficile patogen-specifika antikroppen svaren i denna analys.

Många friska barn och vuxna har detekterbara serum IgG och IgA antikroppar mot C. difficile toxiner A och B^5,6. Dessa tros uppstå efter övergående exponering under spädbarnstiden och efter exponering för C. difficile i vuxen ålder. Av denna anledning polyklonala IVIg har varit används off-label för att behandla både återkommande och fulminant CDI^7,8,9. Dock oklar sin slutgiltiga roll och verkningsmekanismen. Flera studier har visat att det humorala immunsvaret för C. difficile toxiner spelar en roll i sjukdomen presentation och resultatet. Specifikt, uppvisar asymtomatiska patienter en ökad anti toxin A IgG koncentration i serum jämfört med patienter som utvecklar symtomatisk sjukdom¹⁰. En påvisbar association har rapporterats för median anti toxin A IgG titrar och 30-dagars totalmortalitet¹¹. Flera rapporter har också visat en association med ett skydd mot återfall och antikroppen Svaren till toxin A, B och flera icke-toxin antigener (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD och ytskiktet proteiner (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. dessa observationer har sporrat utvecklingen av den första passiva immunterapi drog inriktning C. difficile toxinen B (bezlotuxumab), som nyligen har godkänts av den amerikanska Food and Drug Administration och Europeiska läkemedelsmyndighetens Byrån för förebyggande av återkommande CDI¹⁶. Vaccination strategier med inaktiverade toxiner eller rekombinant toxin fragment är också för närvarande under utveckling^17,18,19. Dessa nya terapeutiska strategier kommer utan tvekan att stimulera krav på utvärdering humorala immunsvar mot flera antigener i stort urvalsstorlekar.

Idag finns det en anmärkningsvärd brist på kommersiellt tillgängliga hög genomströmning analyser kan samtidigt bedöma bakteriestam och isotyp-specifika antikroppssvaret mot C. difficile antigener. I området i närheten finns det ett icke tillgodosett behov att utveckla sådana analyser för att underlätta framtida forskningsinsatser och kliniska tillämpningar. Protein microarrays är en metod för att immobilisera stort antal individuellt-renat protein som en rumsligt organiserade matris av fläckar på en mikroskopisk bild-baserade yta med hjälp av en robotarm-system, som kan vara antingen en kontakt²⁰ eller en icke-kontakt skriva ut verktyg²¹. Fläckarna kan representera komplexa blandningar såsom cell lysates, antikroppar, vävnad homogenates, endogen eller rekombinanta proteiner eller peptider, kroppsvätskor eller droger^22,23.

Protein Mikroarrayteknik erbjuder tydliga fördelar jämfört med standard in-house ELISA teknik, som har traditionellt använts för att bedöma anti –C. difficile antikroppssvar. Dessa inkluderar en ökad kapacitet för att upptäcka ett utbud av multi-isotyp-specifika antikroppar mot en mer omfattande panel av protein mål, minskad volymkrav för antigener, prover och reagenser, och en ökad förmåga att införliva en större antal tekniska replikat, förutom flera interna kvalitetskontroll (QC) mäter¹. Microarrays är därför mer känsliga, exakt och reproducerbar och har en större dynamiskt omfång. Dessa faktorer gör microarrays ett billigare och potentiellt gynnsamma alternativ till ELISAs för storskaliga detektion av kända proteiner. Men nackdelarna med Mikroarrayteknik leda främst från stora initiala kostnader i samband med att upprätta en panel av högrenade antigener och inrätta en teknisk plattform.

Protein microarrays har använts flitigt under de senaste två decennierna som ett verktyg för diagnostik och grundläggande forskning i kliniska tillämpningar. Specifika tillämpningar inkluderar proteinuttryck profilering, studiet av enzym-substrat relationer, biomarkör screening, analys av värd-mikrobinteraktioner, och profilering antikropp specificitet^{23,24, 25,26,27,28}. Många nya patogen protein/antigen microarrays har fastställts, inklusive malaria (Plasmodium)²⁹, HIV-1³⁰, influensa³¹, svår akut respiratorisk sjukdom (SARS)³², viral hemorragisk feber³³ , herpesviruses³⁴, och tuberkulos³⁵.

Detta protokoll gäller inrättandet av en lätt operativa C. difficile reaktiva antigen microarray analys, som möjliggör korrekt, exakt och specifika kvantifiering av multi-isotyp och stamspecifika antikroppssvaret mot C. difficile antigener i sera och polyklonala IVIg. Häri, inkluderar vi representativa resultat som hänför sig till en godtagbar microarray analys prestanda i jämförelse med ELISA samt Analysens precision och reproducerbarhet profiler. Denna analys kan utvecklas ytterligare för att profilera andra kliniska prover och sätter en ny standard för forskning i den molekylära basen för CDI.

Protocol

1. förbereda en Microarray tallrik Späd C. difficile antigener med en utskrift buffert [PBS-Tween-trehalos (50 mM)] på den optimala koncentrationen (som var fördefinierade innan du kör patientsera): toxin en (200 µg/mL) och toxin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), och renad native hela SLPs härrör från ribotypes 001, 002 och 027 (200 µg/mL).Obs: Toxin B erhölls från ett toxin B-uttryckande stam CCUG 20309 (90 µg/mL). Späd de positiva kontrollerna, lysates av C. albicans</…

Representative Results

Figur 1 visar ett flödesschema som beskriver de stora stegen i protokollet beskrivs. Figur 2 visar Spearman korrelation tester visar betydande avtal mellan microarray och ELISA IgG och IgA anti toxin A och B nivåer i patientens testserumen. Figur 3 visar differentiell IgG och IgA antikroppar-klass specifika antikroppen Svaren till toxin A, toxin B och binära toxin (pCDTb) hos patienter med CF utan…

Discussion

I detta protokoll, har vi visat att microarray är en lämplig plattform för att definiera humorala immunsvar mot C. difficile proteinantigener i patientsera (figur 3 och 6) och kommersiella preparat av IVIg (figur 5). Vi har också visat att microarray tekniken presterar väl jämfört med konventionella ELISA (figur 2) och visar utmärkt reproducerbarhet, med intra – och inter – analysen variabilitet som faller inom …

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A