레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)
Summary
여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.
Abstract
결핵은 여전히 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인. 기존 약물 regimens 개선 및 새로운 치료제의 개발 시급히 필요 됩니다. 도달 하 고 저조한 나가도록 괴 지역 (caseum) 폐 육아의 박테리아 살 균 약 복용된 결핵 약의 능력은 성공적인 치료 적 개입에 대 한 중요 합니다. 효과적인 치료 regimens 따라서 유리한 caseum 침투 특성을 가진 약물을 포함 해야 합니다. 생물 조직에 마약 수준 측정을 위한 현재 LC/MS 방법 제한 된 해상도 기능, 그 안에 발견 같은 작은 조직 구획 내에서 절대 약물 농도 정확 하 게 결정 하 고 어려운 괴 사 성 육아입니다. 여기 우리는 LC/MS 정량화와 병 적 별개 조직 영역의 레이저 캡처 기정 (LCM)를 결합 하는 프로토콜을 제시. 이 기술은 육아 caseum, 세포 병 변 및 uninvolved 폐 조직 내 약물의 절대 정량화 하며, 따라서, 정확 하 게 살 균 농도 달성 되 고 있는지 여부를 결정 합니다. 결핵 연구, 뿐만 아니라 기술 병 조직에 약물의 공간 해결 정량화에 대 한 많은 잠재적인 응용 프로그램을 하고있다.
Introduction
공간을 해결 하 고 마약 수준 계량 능력 결핵 약물 농도1살 균에서 폐 병 변 내의 박테리아 모집단에 도달 여부를 결정 하기 위한 중요 한 요구 사항입니다. 특별 한 중요성의 일반적으로 이십시오의 가장 높은 수를 포함 하 고 마약 vascularization의 부재 때문에 액세스할 수 있습니다 (caseum 라고) 하는 병 변의 괴 핵심으로 약물 침투를 결정 이다.
삭제 폐 병 변의 균질 화를 포함 하는 병 변 침투를 평가 하기 위해 전통적인 방법 뒤에 용 매 추출 및 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC/MS) 분석, 매우 민감하고의 마약에 대 한 선택적 관심입니다. 그러나,이 메서드는 원래 무 균된 조직의 크기를 제한 하는 불 쌍 한 공간 정보를 제공 합니다. 질량 분석 기반 이미징 등 방법을 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 (MALDI)2,3, desorption 분무 이온화 (DESI)4 또는 표면 추출 액체 강화 된5, 6 높은 공간 해결 이미징 기능을 제공 하지만 직접 정량화는 매우 도전적인 또는 이기종 이온 억제 효과 및 다양 한 셀에서 분석의 다른 추출 효율 불가능 한 수 또는 조직의 종류7. 또한, 가장 직접적인 조직 MS 이미징 접근은 본질적으로 생 종 이온화와 조직에서 약물의 낮은 용 매 추출 효율에 대 한 경쟁의 컬럼에 분리의 부족 때문에 LC/MS 보다 덜 민감한.
레이저 캡처 기정 (LCM) LC/MS 분석을 함께 정기적으로 격리 및 proteomic 연구8,9 에 대 한 뚜렷한 조직 지역 특성화에 적용 되었으며 최근 약물 정량화에 대 한 활용에 복용 동물 조직10. 여기 선물이 적용 LCM (LCM-LC/MS) LC/MS 분석을 결합해 독특한 육아 구획 내에서 안티-결핵 약물을 계량 하는 최적화 된 프로토콜. 레이저 캡처 서 과정에서 UV 레이저는 현미경 목표는 사용자에 의해 정의 된 경로 따라 원하는 조직 영역을 분리 하 고 조직 섹션에를 통해 집중 된다. 중력 지원 lcm (이 연구에 사용 하는 기법), 조직 섹션 얇은 고분자 막 슬라이드 (PET 또는 펜)에 탑재 되 고 조직 슬라이드 아래 sited 컬렉션 튜브 캡에 캡처됩니다. 마약 삭제 조직에서 추출 되 고 표준 LC/MS 접근을 사용 하 여 계량. 수집 하는 데 필요한 조직의 양은 궁극적으로 조직에 존재 하는 약물의 예상된 농도 및 LC/MS 방법의 감도에서 결정 됩니다. 대부분의 약물 치료 수준에서 약을 복용 하 고 조직의 일상적인 트리플 4 극 자 질량 분석기, 3 백만 µ m2 (3 m m2)를 사용 하 여 분석의 분석에 대 한 표면적은 충분 합니다.
이 프로토콜 공간 프로 파일링의 강력한 조합을 설명 하 고 전체 정량화 LCM-LC/MS, 결핵 육아의 모든 구획 내에서 절대 약물 농도 제공 제공. 기술은 또한 중요 한 약물 발견과 개발 정보를 제공 하 많은 다른 병에 걸리는 조직에 약물 농도 결정에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공간 해결 정량화 폐 결핵 병 변 내 약물의 약물 노출에 다른 병 변 구획 내에서 거주 하는 세균성 인구에 살 균 농도 도달 여부를 확인 하기 위해 필요 합니다. 여기에 설명 된 LCM-LC/MS 메서드는 총에서만 1-3 조직 단면도 사용 하 여 박테리아-부유한 caseum를 포함 하 여 모든 병 변 구획 내에서 안티-결핵 약물의 절대 정량화를 수 있습니다. 전통적인 조직 균질 및 LC/MS 방법 조직에 마약 정량화 종종 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 폴 오 브라이언, 감사 미 나 Marizel와 동물 실험에 대 한 이자벨 프리먼, Jacquie 곤잘레스 NIH/NIAID에서 다니엘 이너 원고에 대 한 레이저 캡처 기정 Jansy Sarathy 이전 토끼 조직의 감마 방사선에 대 한 생각과 조언입니다. 이 작품은 법안에서 자금에 의해 지원 되었다 고 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1174780)와 공유 하는 NIH 계측 1S10OD018072를 부여 합니다. 우리 감사 Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 현미경에 대 한 액세스를 제공 하 고 전문 지식 및 조언을 공유. 구입, 그리고 지속적인 지원, LMD 6500는 국립 정신 건강 연구소 그랜트, MH096625, 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기, NS105584, PHRI (E.A.E)에 자금와 GSK 기여 (E.A.E)에 의해 투자 되었다.
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
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