Questo protocollo descrive un metodo di preparazione arricchite stomatica cellule di guardia che è utile per gli studi biologici fisiologici e altri.
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Articolo metodologico
Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio delle cellule di guardia è essenziale per la conoscenza dei contributi specifici di questo tipo di cella alla funzione generale delle piante. Tuttavia, è spesso difficile isolare e così loro studio spesso rappresenta una sfida.
Questo studio stabilisce un metodo di arricchimento stomatica delle cellule di guardia. Il protocollo utilizza nastro Scotch per isolare cellule di guardia ed estrarre le proteine dalle cellule. Questo metodo migliora l'integrità e il rendimento della cella di guardia durante l'isolamento e fornisce un campione affidabile per lo studio dei processi di segnalazione delle cellule e come essi correlare ai fenotipi movimento stomatica. In questo metodo, le foglie delle piante erano divise tra i due porzioni di nastro e pelate a pezzi per rimuovere il lato abbagliai. Questo protocollo è stato applicato al tessuto di foglia di Arabidopsis per isolare cellule di guardia. Le cellule sono state trattate con diacetato di fluoresceina (FDA) per determinare la vitalità e l'acido abscissico (ABA) per valutare il movimento di stomi in risposta all'ABA. In conclusione, il presente protocollo si rivela utile per la preparazione di cellule di guardia stomatica arricchite e isolare proteine. La qualità delle cellule e proteine ottenute qui enable fisiologico e altri studi biologici.
Introduzione
Gli stomi giocano un ruolo importante nella fisiologia complessiva e fitness delle piante. Queste strutture specifiche di pianta molto piccola sono formate da due cellule epidermiche specializzate, conosciute come cellule di guardia e si trovano più abbondantemente sulla superficie abbagliai delle foglie. Gli stomi sono necessari per lo scambio di gas tra la pianta e l'atmosfera, nonché il controllo della perdita di acqua attraverso la traspirazione. Cellule di guardia regolare apertura stomi attraverso l'integrazione di diversi esterni (ad es., luce, umidità, contatto agente patogeno, livelli di anidride carbonica) e interni (ad es., ormoni endogeni....
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Protocollo
1. coltivazione di piante
- Germinare i semi in miscela di impregnazione. Crescere le piante in una camera di crescita con un'intensità luminosa di 140 µmol fotoni m− 2 s − 1 e un fotoperiodo di luce 8 h a 22 ° C e h 16 scuro a 18 ° C per 2 settimane.
- Trapiantare le piantine di simili dimensioni singolarmente in vasi di diametro 4" contenente il terreno e crescere per un ulteriore 3 settimane nelle stesse condizioni descritte al punto 1.1.
Nota: Acqua piante con acqua del rubinetto due volte a settimana per mantenere il terreno umido.
2. preparazione di stomi arricchiti
- Rimuovere le....
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Risultati
Un'immagine rappresentativa di Arabidopsis cellule di guardia prima e dopo la digestione del mesofillo e cellule epidermiche è illustrata nella Figura 1. Attuabilità delle cellule di guardia prima e dopo la rimozione del mesofillo e cellule epidermiche possono essere osservate utilizzando FDA per misurare l'attività enzimatica e l'integrità della membrana delle cellule (Figura 1B e 1D). La fi.......
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Discussione
Cellule di guardia sono un sistema modello per studiare i meccanismi di trasduzione del segnale nelle piante ed è importante garantire che la preparazione dei campioni utilizzati nello studio è il più appropriato per rispondere alle domande biologiche. Nonostante il crescente interesse in cellule di guardia all'interno della comunità di ricerca di pianta, non esiste un metodo universale su come preparare stomatica cellule di guardia che permettesse sia il movimento stomatica e fisiologia così come i cambiamenti molecolar.......
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Dichiarazioni
Conflitti di interesse non dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Daniel Chen dalla Digital Video produzione Team di Buchholz High School per assistenza nell'editing del video. Questa ricerca su cellule di guardia stomatica, proteomica e metabolomica in laboratorio Chen è stata sostenuta da sovvenzioni dal US National Science Foundation (0818051, 1158000 e 1412547). Wenwen Kong è supportato dal Consiglio di borsa di studio di Cina. Dr. Qiuying Pang è supportato dalla Cina Scholarship Council e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31570396).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
Piuma chirurgica del NC9999403PI78443del software
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| bisturi in acciaio inossidabile | |||
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Piastra di Petri | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulasi (Onozuka R-10) | Fornitore verificato - Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscopio | Leica Microsystems | ||
| Cocktail di Inibitori della Proteasi e della Fosfatasi | Thermo Fisher Scientific | ||
| Oak Ridge Provette per centrifuga PPCO ad alta velocità | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| Kit di quantificazione delle proteine EZQ | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Diacetato di fluoresceina (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Acido abscissico | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Aziende | TX-500 | |
| Laemmli Tampone per campioni | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Provetta per microcentrifuga (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| Pinzette | dell'Istituto Nazionale di Sanità | ||
| ImageJ | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricato | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Vetrini per microscopio | Fisherbrand | 12-550-A3 |
Riferimenti
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M.
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Ristampe e permessi
