我们提出了一种用于比较两种人源成骨细胞系hFOB 1.19和Saos-2释放的囊泡中矿物质状态的实验方案。通过茜素红-S（AR-S）染色、紫外（UV）光观察、透射电子显微镜（TEM）成像以及能量色散X射线微区分析（EDX）对它们的矿化特征进行了分析。
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摘要
摘要
本视频介绍了利用透射电子显微镜结合能量色散X射线微区分析（TEM-EDX）技术，比较两种人源成骨细胞系hFOB 1.19和Saos-2所释放囊泡中矿物质的存在状态。这两种细胞系在经抗坏血酸（AA）和β-甘油磷酸钠（β-GP）处理后，会经历从增殖到矿化的完整成骨转分化过程，并产生基质囊泡（MVs），从而在细胞外基质（ECM）中引发磷灰石的成核作用。
根据茜素红-S（AR-S）染色以及采用紫外光（UV）对细胞裂解液中的矿物质成分进行分析，或通过透射电子显微镜（TEM）成像观察囊泡中的矿化情况，再结合EDX定量分析和离子定位图谱，可以推断出骨肉瘤Saos-2细胞和成骨样hFOB 1.19细胞具有不同的矿化特征。Saos-2细胞的矿化效率高于hFOB 1.19细胞，并形成更大的矿化沉积物；这些沉积物在紫外光下不可见，但其特性类似于羟基磷灰石（HA），含有更多的钙（Ca）和氟（F）取代成分。
利用这些技术获得的结果使我们能够得出结论：矿化过程因细胞类型的不同而有所差异。我们提出，在细胞水平上，囊泡的来源及其特性决定了矿物的类型。
引言
骨是一种结缔组织，由两部分组成：有机成分（细胞和胶原纤维）和无机矿物成分（钙和磷酸盐化合物）。骨骼中的主要矿物成分为磷灰石1。骨组织中具有矿化能力的细胞（成骨细胞）、牙齿中的细胞（成牙本质细胞）以及软骨中的细胞（软骨细胞）通过合成细胞外基质（ECM）蛋白并释放基质小泡（MVs）来调控矿化的初始阶段（图1）。基质小泡是直径为100–300 nm的囊泡，能够富集钙和磷酸盐，促进磷灰石成核，随后与胶原结合2,3。随后，基质小泡破裂，将磷灰石释放到细胞外环境中。磷灰石在与胶原纤维接触的过程中持续生长，最终形成骨基质。细胞外环境中持续供应的Pi和Ca2+维持了矿化过程。一些最近发表的数据支持我们的模型4,5。在生理条件下，软组织不会发生矿化。然而，在病理状态下可能发生异位钙化，例如血管钙化3。获得成骨细胞表型的血管细胞可产生基质小泡，诱导磷灰石成核，并在血管壁的中膜和内膜层启动矿化过程。由于异位钙化与正常的软骨内矿化过程相似3，因此理解成骨细胞和软骨细胞矿化的分子机....
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方案
1. 细胞培养与处理
- 将所有必需材料放入超净工作台内，并在紫外灯下进行灭菌处理。培养基成分如下：用于人胎成骨细胞hFOB 1.19（SV40大T抗原转染）的培养基为Ham's F12与DMEM培养基1:1混合液，其中添加2.5 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、0.3 mg/mL G418以及10%胎牛血清（FBS，v/v）；用于人骨肉瘤Saos-2细胞的培养基为McCoy's 5A培养基，其中添加1.5 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素以及15%胎牛血清（FBS，v/v）。
- 将hFOB 1.19细胞置于含5% CO2的环境中，于34 °C培养；将Saos-2细胞置于含5% CO2的环境中，于37 °C培养。将细胞培养物（hFOB 1.19或Saos-2细胞）从培养箱转移至超净工作台，更换为10 mL含胎牛血清的新鲜培养基。
- 对细胞进行无刺激培养（静息状态）或加入刺激物诱导：先加入50 µg/mL抗坏血酸（AA），再加入7.5 mM β-甘油磷酸钠（β-GP），上述溶液需预先用超纯水配制并经0.22 µm注射器滤器过滤。将刺激物从塑料微量离心管中直接加至培养基表面，轻轻晃动培养皿混匀，随后继续培养7天。
2. 钙矿物的检测
- 用磷酸盐缓冲液（PBS：125 mM Na....
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结果
TEM-EDX 可实现 体外 矿化细胞释放的基质小泡（MVs）及其矿化产物的成像与 采用该技术获得的结果表明，不同类型的细胞中矿化过程可能以不同的方式进行。两种细胞系接受了相同的成骨转分化处理，但经刺激后，Saos-2 细胞的矿化效率高于 hFOB 1.19 成骨细胞，这一点通过茜素红染色（AR-S 染色）得以证实图2）。这可能是由于Saos-2细胞具有更为成熟的成骨细胞表型19 与 hFOB 1.19 细胞相比20使用紫外透射仪对样品进行观察，结果表明仅氟磷灰石可在紫外光下被观察到图3）。透射电子显微镜图像显示，与刺激的hFOB细胞或静息状态的Saos-2细胞相比，受刺激的Saos-2细胞产生更多含有矿物质的囊泡（图4，左图和中图）。合成磷灰石具有不同形态的矿物（.......
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讨论
在本文中，我们描述了AR-S染色、紫外光下氟磷灰石的鉴定以及透射电镜-能谱分析的实验方案 体外 矿化细胞释放的基质小泡及其矿化产物的成像. 可通过遵循一些常见的故障排除步骤来解决上述所有方法中的问题。为了获得最佳结果，需仔细执行以下几个关键步骤。首先，应先加入酸性的抗坏血酸（AA），再加入碱性的β-甘油磷酸酯（β-GP），以维持培养基的pH值为7.4。其次，经过茜素红S（AR-S）染色后，染色的钙沉积物非常脆弱，在加入磷酸盐缓冲液（PBS）时应小心清洗细胞，以防晶体被破坏。第三，醋酸铀酰应始终保存在铅容器中，且不可取用沉淀部分，仅应使用稀释后的上清液进行固定。第四，需注意抗坏血酸和醋酸铀酰对光敏感，应在暗室中操作。第五，LR White树脂与无水乙醇的混合液在加入样品前应充分混匀。第六，明胶胶囊中的样品应使用小片纸和铅笔进行标记，以避免树脂破坏标签。第七，金刚石刀刃应仔细清除所有气泡。第八，应小心将样品置于载网的光亮面，即涂有Formvar/碳膜的一面。第九，在透射电子显微镜（TEM）图像中进行X射线微分析和离子定位时，应准确定位分析点，以减少羟基磷灰石识别可能出现的问题。
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
MK 和 ASK 进行了实验操作，LB 绘制了图示并制作了视频。ASK 撰写了手稿，LB 撰写了脚本，MK 制作了表格。SM、RB 和 SP 对表格、脚本和手稿进行了批判性审阅。作者感谢 Hanna Chomontowska 在超薄切片技术方面的出色协助，以及 Szymon Suski 和 Henryk Bilski 在透射电子显微镜-能谱分析（TEM-EDX）方面的出色协助。作者感谢 Patrick Groves 博士在英文语言润色方面的专业帮助，以及 Barbara Sobiak 对操作指令的录音工作。
本工作获得了波兰科学与高等教育部授予 ASK 的 N N401 140639 号资助、波兰国家科学中心授予 LB 的 2016/23/N/NZ4/03313 号资助和授予 MK 的 2016/23/N/NZ1/02449 号资助、欧盟第七框架计划项目 BIOIMAGINE：研究创新与教育中的生物成像（BIO-IMAGing in research INnovation and Education），项目编号 GA No. 264173，以及波兰科学院涅恩科夫实验生物学研究所法定资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Ham’s DMEM/F12 培养基混合液 | PAA | E15-813 | 1:1，用于人胎成骨细胞 hFOB 1.19 SV40 大 T 抗原转染细胞（ATCC CRL-11372） |
| McCoy’s 5A 培养基 | PAA | E82312-0025 | 用于人骨肉瘤 Saos-2 细胞（ATCC HTB-85） |
| 抗生素混合液（青霉素/链霉素） | Sigma | P0781-100ML | 各 100 U/mL |
| G-418 | Sigma | 68168 | 0.3 mg/mL |
| FBS | Gibco | 10270 | hFOB 1.19 使用 10%，Saos-2 使用 15% |
| AA | Sigma | A-5960 | 50 µg/mL |
| ß-GP | Sigma | G9422-100G | 7.5 mM |
| Bio-Gel HTP 凝胶 | Bio-Rad | 130-0420 | 用于 HA |
| FA | 由我们合成 | ||
| CA | 由我们合成 | ||
| 磷酸钠缓冲液 Na2HPO4/NaH2PO4 混合液 | Sigma | S7907/S8282 | 0.1 M，pH 7.2 |
| PBS | pH 7.0，由我们配制 | ||
| AR-S 溶于 PBS | Sigma | A5533-25G | 0.5 g/100 mL，pH 5.0 |
| I 型胶原酶 IA | Sigma | C2674 | 500 U/mL |
| SCL 缓冲液 | 由我们配制 | ||
| 去离子水 | 由我们制备 | ||
| 乙醇 | POCh | BA6480111 | 绝对纯度 99.8%，以及 25%、50%、75%、90% 溶液 |
| 50% 乙醇中的醋酸铀 | Polysciences Inc. | 21447-25 | 0.25 g/10 mL |
| PD 培养基 | pH 7.4，由我们配制 | ||
| 固定液（多聚甲醛/戊二醛） | Sigma | 158127/G-6257 | 3%:1% |
| 后固定 OsO4 | Sigma | 75633 | 1% |
| 乙醇中的 LR White 树脂 | Polysciences Inc. | 17411-MUNC 500g | 1:2、1:1、100% |
| 丙酮 | CHEMPUR | 111024800 | 纯品 |
| 工具 | |||
| 冻存管 | Corning Inc. | 430487 | 1.2 mL |
| 塑料培养皿 | Falcon | 353003 | 100 mm |
| 塑料离心管 | Falcon | 352096 和 352070 | 15 和 50 mL |
| 移液管 | Falcon 和 VWR | 357521 和 612-3700 | 1 和 10 mL |
| 塑料微量离心管 | Sigma | Z688312 和 Z628034 | 1.5 mL 黑色和 2 mL 透明 |
| 塑料吸头 | VWR | 613-0364、613-0239 和 613-1050 | 0.1–10 µL 透明、1–200 µL 黄色、200–1000 µL 蓝色 |
| 塑料架 | Light Labs | A-7055-Z、A-7053-C | 绿色用于离心管，橙色用于微量管，蓝色用于透射电镜样品 |
| 层流超净台 Hera Save | Thermo Scientific Co. | KS12 | HEPA 滤器（DIN EN 1822 标准 H14） |
| 培养箱 Hera Cell | Thermo Scientific Co. | 150 | hFOB 1.19 使用 34°C，Saos-2 使用 37°C |
| 通风橱 | POLON | WCS-2 | 用于透射电镜染色 |
| 玻璃瓶 | SIMAX | 1632414501050 和 1632414501100 | 50 和 100 mL |
| 石英玻璃管 | SIMAX | 638422010100 | Ø 10 mm，L 100 mm |
| 泵 | IBS Integra Biosciences | VACUSAFE comfort | 用于抽真空 |
| 烘箱 | Memmert | UNE 400 | 56°C |
| 瓷质多孔板 | Rosenthal technik | 229/12 | 12 孔 |
| 玻璃烧杯 | SIMAX | 632417010025 | 25 mL |
| 玻璃瓶 | Pocord | DIN22 | 10 mL |
| 塑料盒 | Agar Scientific Ltd. | 用于避光 | |
| 明胶胶囊（Snap Fit） | Agar Scientific Ltd. | G3741 | 1 号尺寸 |
| 带 Formvar/碳膜的 300 目镍网（置于盒中） | Agar Scientific Ltd. | S162N3 | 膜面朝亮面 |
| 硅胶细胞刮刀 | Sigma | SIAL0010-100EA | 尺寸 1.8/25 cm |
| 带针头的注射器 | BogMark | 007 | 1 mL 注射器 40 U，针头 0.5 × 16 |
| 注射器 | Chirana | CH005L | 5 mL |
| 离心机 | MPW Medical Instruments | MPW-350R | 130 × g 和 500 × g |
| 紫外透射仪 | UVP | M-20 | 用于可见光和紫外光 |
| 超薄切片机 | LKB | NOVA | 700Å 切片 |
| 样品块夹持器 | LKB | E6711 | 圆形 |
| 金刚石刀 | DiATOME | Ultra 45° | 3 号尺寸 |
| 睫毛夹持器 | 牛源，由我们制备 | ||
| 镊子 | ROTH | 2855.1 | 防静电，用于载网 |
| 刮刀套装 | ROTH | E286.1 | 防静电，用于粉末 |
| 成像 | |||
| 倒置光学显微镜 | Zeiss 配 Canon | AxioObserver Z1 配备 PowerShot G9 | 相差、透射光、20× 物镜、RGB 滤光片 |
| 透射电子显微镜 | TEM Jeol 公司配 Oxford Instruments 和 SiS-Olympus | JEM-1400 TEM 配备全范围 INCA 能谱分析系统（EDX）及 1100 万像素 MORADA G2 相机 | 透射电镜放大倍数 50,000X，STEM 和 EDX 为 15,000X |
| 相机机身与镜头 | Nikon | Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D | 用于视频录制 |
| 麦克风 | MXL Mics | Tempo | 用于语音录制 |
参考文献
- Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
- Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
- Anderson, H. C. Matrix v....
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