शब्द अपरा की भ्रूण झिल्ली से प्राथमिक मानव Decidual कोशिकाओं का अलगाव
Summary
इस प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव decidual शब्द अपरा जो अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की भ्रूण झिल्ली से एकत्र कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है (यानी immunocytochemistry, प्रवाह cytometry, आदि) का लक्ष्य गर्भावस्था जटिलताओं में अलग कोशिका आबादी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए ।
Abstract
decidua, यह भी गर्भवती अंतर्गर्भाशयकला के रूप में जाना जाता है, एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण प्रजनन ऊतक है । Decidual कोशिकाओं, decidualized stromal कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मुख्य रूप से शामिल, हार्मोनल और भड़काऊ कारकों जो सफल ब्लास्टोसिस्ट आरोपण, अपरा विकास और में एक भूमिका निभाने के लिए महत्वपूर्ण है के स्राव के लिए जिंमेदार हैं पद और अपरिपक्वता पर परिश्रम की दीक्षा । कई गर्भावस्था जटिलताओं decidua शामिल विभिंन कोशिका आबादी का एक अच्छा संतुलन के perturbations से पैदा कर सकते हैं । विशिष्ट decidual कोशिका प्रकार के अनुपात में परिवर्तन इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को बाधित और गर्भावस्था की गंभीर जटिलताओं के विकास के जोखिम को बढ़ा सकता है, जैसे भ्रूण आरोपण विफलता, अंतर्गर्भाशयी विकास प्रतिबंध, preeclampsia और अपरिपक्व परिश्रम । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक लागत और प्राथमिक मानव decidual शब्द अपरा के भ्रूण झिल्ली से एकत्र कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रभावी विधि समय प्रदर्शित करता है । एंजाइमी पाचन और decidual ऊतक के कोमल यांत्रिक विघटन के संयोजन के द्वारा, decidual कोशिकाओं की एक उच्च उपज वस्तुतः कोई चोरियों संदूषण के साथ प्राप्त किया गया था । महत्वपूर्ण बात, अलग decidual कोशिकाओं (stromal कोशिकाओं (55-60%), ल्यूकोसाइट्स (३५%), उपकला (1%) या trophoblast (०.०१%) कोशिकाओं) की विशेषता थी और उच्च व्यवहार्यता (८०%) जो बहुरंगा इमेजिंग प्रवाह cytometry परख द्वारा पुष्टि की गई थी । इस प्रोटोकॉल decidua parietalis के लिए विशिष्ट है और पहली और दूसरी तिमाही अपरा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक बार अलग, decidual कोशिकाओं प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के एक भीड़ के लिए विभिंन decidual कोशिका उप की भूमिका को समझने के लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है गर्भावस्था जटिलताओं में आबादी ।
Introduction
अंतर्गर्भाशयकला, सबसे सक्रिय वयस्क महिला ऊतकों में से एक, डिम्बग्रंथि हार्मोन, एस्ट्रोजन (E2) और प्रोजेस्टेरोन (पी 4) द्वारा उत्तेजना के जवाब में एक मासिक धर्म चक्र नाटकीय ढंग से remodeling । decidua, भी गर्भवती अंतर्गर्भाशयकला के रूप में जाना जाता है, एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण प्रजनन ऊतक कि पी 4 के परिणाम के रूप में postovulatory चरण के अंत से बना है, E2-प्रमुख प्रफलन चरण के बाद भिंनता संचालित है । Decidual कोशिकाओं को सफल ब्लास्टोसिस्ट आरोपण के लिए हार्मोनल कारकों के स्राव के लिए और भ्रूण allograft के लिए मातृ सहिष्णुता बनाए रखने के लिए utero-अपरा इंटरफेस के विकास के लिए जिंमेदार हैं ।
Decidualization आरोपण के लिए आवश्यक है और decidual सर्पिल धमनियों के बाद remodeling । एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं decidualization से गुजरना, पी 4 और शिविर के नियंत्रण के तहत, मासिक धर्म चक्र1के देर से लुटियल चरण के दौरान । इस प्रक्रिया को रक्त वाहिकाओं के आसपास शुरू किया और स्ट्रोमा भर में फैलता है, vasculature remodeling और ल्युकोसैट तस्करी विनियमन में अपनी भूमिका का सुझाव है । इस सेलुलर परिवर्तन एक परिपत्र आकृति विज्ञान, वृद्धि की परमाणु आकार, और किसी न किसी endoplasmic जालिका और Golgi तंत्र2के विस्तार की विशेषता है । Decidualized stromal कोशिकाओं ब्लास्टोसिस्ट आरोपण का समर्थन paracrine कारकों का उत्पादन करने में सक्षम हैं और कई हार्मोन (यानी प्रोलैक्टिन) के स्राव की विशेषता, angiogenic वृद्धि कारकों, इंसुलिन वृद्धि कारक बंधन प्रोटीन-1 (IGFBP-1), प्रोस्टाग्लैंडीन (स्नातकोत्तर) ई (intracellular शिविर के उत्तेजित), साइटोकिंस, extracellular मैट्रिक्स अवयव और पोषक तत्वों अपरा आरोपण और विकास के लिए आवश्यक3,4,5,6 .
decidual कोशिका जनसंख्या केवल decidualized stromal कोशिकाओं के शामिल नहीं है, लेकिन यह भी बड़े, गर्भावस्था विशिष्ट decidual ल्युकोसैट आबादी होती है । Decidualization क्षणिक स्थानीयकृत शोफ और प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, वृक्ष कोशिकाओं, और मैक्रोफेज की आमद शामिल है । सबसे बड़ी ल्युकोसैट उपजनसंख्या गर्भाशय NK कोशिकाओं है, सभी मातृ ल्यूकोसाइट्स decidua जो साइटोकिंस और angiogenic कारकों में सहायता कर सकते है की एक स्रोत है घुसपैठ के लगभग 50-70% शामिल है और में वृद्धि गर्भावस्था के दौरान संख्या7। मैक्रोफेज, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की दूसरी सबसे बड़ी उपआबादी होने के नाते, आरोपण साइट के आसपास पाए जाते हैं और गर्भावस्था के दौरान वृद्धि8. वे साइटोकिंस और विकास कारकों जैसे कॉलोनी उत्तेजक कारक (सीएसएफ-1)9, ट्यूमर परिगलन कारक α (TNFα)10 और प्रोस्टाग्लैंडीन (स्नातकोत्तर) ई11के एक स्रोत हैं ।
गर्भावस्था के दौरान, और अवधि के परिश्रम से पहले, decidua साइटोकिंस और chemokines के एक प्रमुख स्रोत मातृ परिधीय ल्युकोसैट सक्रियण और गर्भाशय के ऊतकों में बाद में प्रवास के लिए श्रम शुरू करने के लिए जिंमेदार है । पशु अध्ययन से पता चला है कि कई समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस है अप-श्रम के दौरान माउस decidua में विनियमित, जैसे TNF-a, il-6, il-12, और आईएल-1b12। मानव decidua में, समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस il-1b, il-6 और il-8 (मेजर न्युट्रोफिल chemoattractant) परिश्रम के दौरान उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शन के लिए परिश्रम में नहीं13की तुलना में । ये एक सक्रियकरण और decidual ऊतकों में ल्यूकोसाइट्स की आमद में स्रावित साइटोकिंस परिणाम14; दोनों मानव और चूहे में decidual मैक्रोफेज और न्युट्रोफिल घुसपैठ में वृद्धि की अवधि के परिश्रम के दौरान देखा जाता है, decidual myometrial पूर्ववर्ती घुसपैठ के साथ 4 गुना अधिक, इस दो आसंन गर्भाशय के ऊतकों के बीच सक्रियण का एक झरना का संकेत है 15. ये घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स PGs myometrium16, मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs) के तुल्यकालिक संकुचन को सक्रिय करने के लिए झिल्ली टूटना17,18शुरू करने में सक्षम उत्पादन, साथ ही प्रो भड़काऊ साइटोकिंस गर्भाशय सक्रियकरण प्रक्रिया (‘ cytokine स्टॉर्म ‘) बढ़ाना ।
decidual कोशिकाओं के कई महत्वपूर्ण कार्यों के कारण, इस तरह के आरोपण की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, जल्दी हमल में मातृ-भ्रूण सहिष्णुता को बनाए रखने और पद पर श्रम के सक्रियकरण में भाग लेने के रूप में, विभिन्न विकृतियों के दौरान पैदा कर सकते हैं गर्भावस्था. उदाहरण के लिए, (1) आवर्तक आरोपण विफलता और आवर्तक गर्भावस्था हानि के कारण बांझपन decidual परिपक्वता की विफलता से परिणाम कर सकते हैं; (2) अंतर्गर्भाशयी वृद्धि प्रतिबंध (IUGR) और preeclampsia-decidual जंक्शन पर decidua/अपरा या समझौता संवहनी परिवर्तन के अनुचित विकास और शिथिलता के कारण; साथ ही (3) अपरिपक्व जन्म जो समयपूर्व decidual सक्रियण से परिणाम कर सकते हैं ।
इन प्रमुख विकारों के प्रकाश में vivo अध्ययनों में मानव की नैतिक और व्यावहारिक सीमाओं के साथ युग्मित, प्राथमिक मानव decidual सेल लाइनों की स्थापना के लिए इन विट्रो विश्लेषण के लिए आवश्यक है बेहतर समझने के प्रयोजन के साथ और गर्भावस्था जटिलताओं के नैदानिक प्रबंधन में सुधार. इसलिए, हमारे अनुसंधान का उद्देश्य एक प्रोटोकॉल है जो उच्च कोशिका उपज और अवधि के भ्रूण झिल्ली से एकत्र व्यवहार्यता के साथ मानव प्राथमिक decidual कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुमति देता है विकसित किया गया था । इस वर्तमान प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से एक समय का वर्णन है और लागत प्रभावी विधि decidual कोशिकाओं है जो की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा के विशिष्ट उपप्रकार के अलग करने के लिए इन विट्रो विश्लेषण में । बहुतायत और decidual उप के phenotype के लक्षण वर्णन-अवधि और पहली या दूसरी तिमाही की तुलना में आबादी को मानव हमल भर में अपनी भूमिकाओं को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक लागत और समय प्रभावी प्राथमिक decidual पूरे मानव शब्द अपरा है कि अत्यधिक सुलभ और सीधा है की भ्रूण झिल्ली से एकत्र कोशिकाओं को अलग करने के लिए विधि प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक के लिए दाताओं का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, RCWIH बैंक, और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया मानव नमूनों के लिए प्रसूति और स्त्री रोग के माउंट सिनाई अस्पताल/UHN विभाग । हम Lye लैब के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा, विशेष रूप से डॉ कैरोलीन डुबो देना विधि विकास के साथ उसकी मदद के लिए । यह काम बरोज स्वागत कोष (ग्रांट #1013759) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
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