Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas
Summary
Este protocolo demonstra um método para o isolamento de células de decidual humanas primários coletados de membranas fetais de placentas de termo que podem ser usadas para uma variedade de aplicações (ou seja, imunocitoquímica, citometria de fluxo, etc.) com o objetivo para estudar o papel das populações de células diferentes em complicações na gravidez.
Abstract
A decídua, também conhecida como o endométrio grávida, é um tecido reprodutivo criticamente importante. Células decidual, compostas principalmente de células do estroma decidualized e células do sistema imunológico, são responsáveis pela secreção de fatores hormonais e inflamatórias que são críticos para a implantação bem-sucedida do blastocisto, desenvolvimento da placenta e desempenhar um papel iniciação de trabalho a termo e prematuros. Muitas complicações na gravidez podem surgir de perturbações de um delicado equilíbrio de populações de células diferentes compreendendo decídua. Alterações na proporção de tipos específicos de célula decidual podem atrapalhar esses processos cruciais e aumentar o risco de desenvolver complicações graves de gravidez, tais como falha de implantação do embrião, restrição de crescimento intra-uterino, pré-eclâmpsia e trabalho de parto prematuro. O protocolo descrito aqui demonstra um custo e tempo método eficaz para o isolamento de células humanas primárias de decidual coletado de membranas fetais de placentas de termo. Combinando a digestão enzimática e gentil ruptura mecânica do tecido decidual, obteve-se um alto rendimento de células decidual com virtualmente nenhuma contaminação do córion. Importante, células isoladas decidual foram caracterizadas (células do estroma (55-60%), leucócitos (35%), epitelial (1%) ou as células do trofoblasto (0,01%)) e mantida alta viabilidade (80%), que foi confirmada por multicolor ensaio de citometria de fluxo de imagem. Este protocolo é específico para o parietalis decídua e pode ser adaptado a placentas de primeiro e segundo trimestre. Uma vez isolado, decidual células podem ser usadas para uma infinidade de aplicações experimentais com o objetivo de compreender o papel das subpopulações diferentes célula decidual em complicações na gravidez.
Introduction
O endométrio, um dos mais ativos tecidos femininos adultos, sofre remodelação dramática cada ciclo menstrual, em resposta à estimulação por hormônios ovarianos, estrógeno (E2) e progesterona (P4). A decídua, também conhecida como o endométrio grávida, é um tecido reprodutivo criticamente importante que é formado no final da fase de postovulatory como resultado de diferenciação P4-conduzidos seguindo a fase proliferativa E2-dominante. Decidual células são responsáveis pela secreção de fatores hormonais para implantação do blastocisto bem-sucedida e para o desenvolvimento da interface do utero-placentário para a manutenção de tolerância materna para a fetal aloenxerto.
Decidualization é necessário para a implantação e posterior remodelação das artérias espirais decidual. Células do estroma endometriais sofrem decidualization, sob o controle de P4 e acampamento, durante o final da fase lútea do ciclo menstrual1. Esse processo é iniciado em torno dos vasos sanguíneos e se espalha por todo o estroma, sugerindo seu papel na vasculatura remodelação e leucócitos tráfico de regulamento. Esta transformação celular é caracterizada por uma morfologia circular, aumento do tamanho nuclear e expansão do retículo endoplasmático rugoso e complexo de Golgi2. Decidualized células do estroma são capazes de produzir fatores parácrina, apoiando a implantação do blastocisto e caracteriza-se pela secreção de vários hormônios (ou seja, prolactina), fatores de crescimento angiogênico, fator de crescimento insulina ligação proteína-1 (IGFBP-1), prostaglandina (PG) E (estimulador de cAMP intracelular), citocinas, componentes da matriz extracelular e nutrientes essenciais para placentária implantação e desenvolvimento3,4,5,6 .
A população de célula decidual não é exclusivamente composta por células do estroma decidualized mas também contém populações grandes, gravidez específicos leucócitos decidual. Decidualization envolve edema localizada transitória e influxo de assassino naturais (NK) células, as células T, células dendríticas e macrófagos. A maior subpopulação de leucócitos é as células NK uterinas, compreendendo aproximadamente 50-70% de todos os leucócitos maternos infiltrando a decidua que são uma fonte de citocinas e fatores de angiogênico que podem auxiliar no processo de decidualization e aumento da número em toda gravidez7. Os macrófagos, sendo a segundo maior subpopulação de células do sistema imunológico, são encontrados ao redor do local de implantação e aumentam durante a gravidez8. Eles são uma fonte de citocinas e fatores de crescimento como colônia de factor (CSF-1)9, fator de necrose tumoral alfa (TNFa)10 e prostaglandina (PG) E11.
Durante toda a gravidez e antes do parto, a decídua é uma importante fonte de citocinas e quimiocinas responsáveis pela ativação dos leucócitos periféricos materna e subsequente migração para os tecidos uterinos para iniciar o trabalho de parto. Estudos em animais mostraram que numerosas citocinas pró-inflamatórias são acima-está regulada no decídua do rato durante o parto, tais como TNF-a, IL-6, IL-12 e IL-1b12. Na decídua humana, citocinas pró-inflamatórias IL-1b, IL-6 e IL-8 (principal neutrófilo quimiotático) apresentam maior expressão durante o parto, em comparação com não no trabalho13. Estas citocinas resulta em uma ativação e o influxo de leucócitos secretada de tecidos decidual14; um aumento no macrófago decidual e infiltração de neutrófilos em ambos os humanos e ratos é visto durante o parto, com infiltração decidual anterior myometrial 4-fold maior, indicando uma cascata de ativação entre este dois adjacentes tecidos uterinos 15. estes infiltração de leucócitos produzem capaz de ativar síncronas contrações do miométrio16PGs, metaloproteinases da matriz (MMPs) para iniciar a membrana rompem17,18, bem como citocinas pró-inflamatórias para amplificar o processo de ativação uterina (tempestade de citocinas).
Devido a muitas funções importantes das células decidual, como jogar um papel crítico no processo de implantação, manutenção de tolerância materno-fetal em gestação precoce e participa na ativação de trabalho a termo, diferentes patologias podem surgir durante a gravidez. Por exemplo, (1) infertilidade devido a falha de implantação recorrentes e perda recorrente da gravidez pode resultar de uma insuficiência de maturação decidual; (2) restrição de crescimento intra-uterino (IUGR) e pré-eclâmpsia devido ao desenvolvimento inadequado e disfunção da decídua/placenta ou comprometimento vascular transformação na junção decidual-myometrial; assim como o nascimento prematuro (3) que pode resultar de ativação prematura decidual.
À luz destes grandes transtornos, juntamente com as limitações éticas e práticas dos estudos humanos na vivo , estabelecer linhas de célula decidual humano primário é essencial para a análise em vitro com o objetivo de melhor compreensão e melhorar o manejo clínico de complicações na gravidez. Portanto, o objetivo da nossa pesquisa foi desenvolver um protocolo que permite o isolamento de células humanas de decidual primários com celular alto rendimento e viabilidade coletados de membranas fetais de placentas de termo. Este protocolo atual claramente descreve um método de tempo – e cost – effective para isolar dos subtipos específicos de decidual células que ser usado para uma variedade de análises em vitro . Caracterização da abundância e fenótipo de sub-populações decidual no termo e comparação com o primeiro ou segundo trimestre são cruciais para a definição de seus papéis ao longo da gestação humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui demonstra um custo e tempo eficaz método para isolar células decidual primárias coletado de membranas fetais de placentas termo humano altamente acessível e simples. O sucesso do presente protocolo é dependente de dois fatores críticos, (1) eficiência de raspagem decidual da camada córion das membranas fetais e (2) o cuidado com que as células decidual são tratadas em todo o protocolo. É importante que contaminação de tecido córion é controlada por garantir que nenhum é acidental…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer os doadores, o biobanco de RCWIH e o Hospital Monte Sinai/UHN, departamento de obstetrícia e Ginecologia para os espécimes humanos utilizados neste estudo. Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório de soda cáustica, particularmente o Dr. Caroline Dunk por sua ajuda com o desenvolvimento do método. Este trabalho é apoiado pelo fundo de boas-vindas de Burroughs (grant #1013759).
Materials
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
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