Identificatie van Dopamine D1-Alpha Receptor binnen knaagdier Nucleus Accumbens door een innovatieve RNA In Situ de technologie van de opsporing
Summary
Identificatie van dopamine D1-alpha receptor in de nucleus accumbens is van cruciaal belang voor de verduidelijking van de D1-receptor dysfunctie tijdens een ziekte van het centrale zenuwstelsel. Wij uitgevoerd een roman RNA in situ hybridisatie assay om te visualiseren single molecules van RNA in een specifieke hersenen gebied.
Abstract
In het centrale zenuwstelsel is de receptor subtype D1-alpha (Drd1α) de meest voorkomende dopamine (DA) receptor, die een essentiële rol speelt bij het reguleren van de neuronale groei en ontwikkeling. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de Drd1α receptor afwijkingen bemiddelen gedrags reacties en modulerende werking geheugenfunctie zijn echter nog onduidelijk. Met behulp van een roman RNA in situ hybridisatie assay, de huidige studie is gebleken dat dopamine Drd1α receptor en tyrosine hydroxylase (TH) RNA-expressie aan vanaf DA-gerelateerde circuits in de nucleus accumbens (NAc) gebied en de substantia nigra regio (SNR), respectievelijk. Drd1α expressie in de nar toont een “discrete stip” kleuring patroon. Duidelijk seks verschillen in Drd1α expressie werden waargenomen. In tegenstelling, bevat TH een “geclusterde” kleuring patroon. Met betrekking tot TH expressie, maar dan weergegeven vrouwelijke ratten een hogere signaal-expressie per cel ten opzichte van mannelijke dieren. De hier gepresenteerde methoden bieden een roman in situ hybridisatie techniek voor het onderzoeken van veranderingen in dopamine systeem dysfunctie tijdens de progressie van ziekten van het centrale zenuwstelsel.
Introduction
Dysfunctie van het systeem van striatale dopamine is betrokken bij de progressie van klinische symptomen waargenomen in meerdere Neurocognitieve ziekten. Dopamine D1 receptoren zijn aanwezig in de prefrontale cortex (PFC) en striatale gebieden van de hersenen en sterk beïnvloeden van cognitieve processen1, waaronder het werken geheugen, temporal processing en locomotief gedrag2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. vorige studies toegelicht dat wijzigingen van dopamine D1 receptoren geassocieerd met de progressie van aandacht tekort-hyperactivity disorder (ADHD)8, de neurocognitieve symptomen bij schizofrenie9, werden 10 en stress gevoeligheid11. In het bijzonder bij schizofrenie, positron emissie tomografie (PET) onderzoeken aangegeven dat het bindend vermogen van dopamine D1 receptoren in de prefrontale cortices was sterk gerelateerd aan cognitieve tekorten en de aanwezigheid van negatieve symptomen11. De dendritische groei van de excitatory neuronen in de prefrontale cortex, gereguleerd door de dopamine D1-receptor vermindert stress gevoeligheid. Bovendien zou het knockdown van D1 receptor in mediale prefrontale corticale (mPFC) neuronen vergroten de sociale nederlaag sociale vermijden stress-geïnduceerde12.
Hier introduceren wij een nieuwe techniek voor RNA in situ hybridisatie te visualiseren van afzonderlijke RNA-moleculen in een cel met vers bevroren weefselmonsters. De huidige techniek heeft meerdere voordelen ten opzichte van de methoden die bestaan binnen de huidige literatuur. Ten eerste, de huidige procedure behoudt de ruimtelijke en morfologische context van het weefsel en werd uitgevoerd op vers bevroren weefselsteekproeven zodat andere procedures vereisen verse, niet-embedded weefsels kunnen worden gecombineerd met de huidige methoden. Soortgelijke procedures in formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefsels hebben geïllustreerd dat één transcriptie resolutie kan worden bereikt gebruikend een RNA in situ hybridisatie techniek13. Opsporing van RNA op het niveau van één transcriptie biedt superieure gevoeligheid voor laag kopie numerieke uitdrukking, evenals de mogelijkheid om te vergelijken van genexpressie op het niveau van afzonderlijke cellen die niet kan worden bereikt door andere methoden voor de detectie van nucleic zuur, zoals polymerase kettingreactie (PCR) technieken. Daarnaast onderhoudt de huidige methode beelden met een hoge signaal-/ ruisverhouding via zeer specifieke sondes van RNA die gekruist doel RNA uitgeschreven, en achter elkaar gebonden met een cascade van versterking signaalmoleculen in de opsporing systeem. Tot slot, de huidige technologie biedt de mogelijkheid te evalueren meerdere biologische systemen met haar doelgroepen gerichte merkgebonden sondes, in plaats van het beperken van ons onderzoek naar slechts één klasse van systeem-gerelateerde gegevensmarkeringen bijvoorbeeld eiwit detectie door Immunohistochemistry methoden.
In onze studie gebruikten we deze roman RNA in situ hybridisatie te evalueren van de Drd1α receptor expressie in de nucleus accumbens (NAc) en tyrosine hydroxylase (TH) expressie in de substantia nigra (SNR) voor zowel mannelijke als vrouwelijke F344/N rats. De innovatieve RNA in situ hybridisatie konden we mechanismen beïnvloeden zowel opname van de DA en DA release gelijktijdig, verbetering van ons inzicht in de complexiteit van het systeem van striatale DA onderzoeken. Hier beschrijven we de procedure voor hersenen vers bevroren plakjes en voorzien in methoden van data-analyse voor kleuring kruisbare: “discrete stip” of “clusters”.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we een nieuwe techniek van in situ hybridisatie voor hersenen vers bevroren plakjes Drd1α receptor expressie in de nucleus accumbens (NAc) en tyrosine hydroxylase (TH) expressie in de substantia nigra (SNR)-regio te evalueren. We bieden ook methoden van data-analyse voor kleuring kruisbare: “discrete stip” of “clusters”.
De kritische stappen voor een succesvolle multiplex fluorescentie RNA in situ hybridisatie assay zijn opgenomen. Zodra het ontho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De huidige werken werden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies, HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624. Gedeeltelijke Fonds werd verstrekt door een subsidie van de opleiding NIH T32 in biomedische-Behavioral science.
Materials
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).
