Method Article

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/57447

⸱

July 12th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 4Center for Lung Biology, University of South Alabama

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חולים ששרדו דלקת ריאות רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר השחרור החולים. זה היה שיערו כי דלקת של רקמת הריאה במהלך דלקת ריאות תוצאות בייצור של cytotoxins חיים ארוכים זה יכול להוביל לכשל איברים סיום עוקבות. פיתחנו במבחנה מבחני כדי לבדוק את ההשערה כי cytotoxins מיוצרים במהלך זיהום ריאתי. תאי אנדותל הריאות עכברוש מבודד, החיידק Pseudomonas aeruginosa משמשים מודל מערכות, והפגינו הייצור של cytoxins בעקבות זיהום של תאי אנדותל על ידי החיידקים היא באמצעות תרבית תאים ואחריו כימות ישירה באמצעות מבחני לקטט דהידרוגנאז שיטה מיקרוסקופיים ניצול טכנולוגיית ImageJ. מהות עמילואיד cytotoxins האלה הודגם על ידי מבחני הכריכה T thioflavin על ידי immunoblotting ו- immunodepletion באמצעות נוגדן נגד עמילואיד A11. ניתוחים נוספים באמצעות immunoblotting הפגינו טאו oligomeric ו- Aβ המיוצר ושוחרר על ידי תאי אנדותל בעקבות זיהום aeruginosa פ. שיטות אלה צריך להיות בקלות להתאמה ניתוחים של דגימות קליניות אנושי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חולים ששרדו דלקת ריאות. רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר החולים פריקה1,2,3,4,5,6. ברוב המקרים, מוות מתרחשת על ידי סוג של כשל איברים סוף כולל כליות, ריאות, לב, או אירועים הכבד, כמו גם קו5,6. הסיבה שיעור התמותה גבוה באוכלוסיית חולים זו מעולם לא נקבעה.

דלקת ריאות מסווג כ להיות גם הקהילה רכשה או רכשה החולים (nosocomial), סוכנים שיכולים לגרום לדלקת ריאות כוללים חיידקים, וירוסים, פטריות וכימ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים נבחנו, אושרה על ידי גופים מוסדיים ועדת אכפת לי חיה של אוניברסיטת דרום אלבמה, בוצעו בהתאם לתקנות הפדרלי, המדינה, והמקומיים כל. תרבויות העיקרי של עכברוש microvascular אנדותל תאי הריאות (PMVECs) התקבלו מהמתקן תא תרבות הליבה במרכז אוניברסיטת דרום אלבמה עבור ריאות ביולוגיה. תאים הוכנו באמצעות הליכים שתואר לעיל16.

1. דור של Supernatants ציטוטוקסיות

הערה: כאן, אנו משתמשים שני זנים שונים של aeruginosa פ: PA103, הכולל מערכת הפרשת השלישי סוג שלם מסוגל להעביר את exoenzymes ExoU, ExoT לתאי המטרה במהלך זיהום, ∆PcrV, אשר חסרה סוג מערכת הפרשת השלישי היא לא מסוגל העברת exoenzy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay פשוטה במבחנה פותחה כדי assay לנוכחות של cytotoxins ב supernatants של תאים נגועים החיידק aeruginosa פ. בעיקרון, האמצעי התרבות תאים נגועים נאסף 4 שעות לאחר תוספת חיידקים, החיידקים יוסרו על ידי מסנן עיקור של התרבות supernatant, ואז תגובת שיקוע סטרילי מתווסף אוכלוסיה חדשה של תאים. התאים ואז שנצפו 21-24 שעות לאחר התוספת של תגובת שיקוע, הרג תא הוא לכמת.

תוספת של aeruginosa פ לשכבות confluent של PMVECs .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. הנה, שיטות פשוטות במבחנה מתוארים אשר מאפשרים הפגנה של הדור של amyloids ציטוטוקסיות במהלך זיהום עם דלקת ריאות גורמת האורגניזם. שיטות אלה כוללים תא תרבות cytotoxicity assay, immunoblotting, כימות של תא להרוג באמצעות שיטת מיקרוסקופיים הרומן, ThT מחייב. ניתוחים של הסוכנים ציטוטוקסיות הוכיחו כי הם עמילואיד בטבע (איור 2 , איור 4), מייצגים מאפיינים של פריון12. הדור של מולקולות פריון ציטוטוקסיות במהלך דלקת ריאות מספק.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן חלקים על ידי NIH מענקים HL66299 TS, RB ו SL, HL60024 ל TS, HL136869 ל MF.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ארנב אנטי בטא עמילואידתרמו71-5800
A11 נוגדן עמילואיד אוליגומרStressMarqSPC-506D
T22 נוגדן נגד טאו אוליגומרEMD MilliporeABN454
תיופלווין Tסיגמא אולדריץ'T3516
HBSSGibco14025-092
PBSGibco10010-023
מסנני מזרק 0.22 מיקרוןMilliporeSLGP033RS
DMEMGibco11965-092
HRP עיזים נגד ארנב IgGAbcamab6721-1
זנים PA103 ו-Δ PcrVזנים אלה של P. aeruginosa התקבלו מד"ר דארה פרנק, המכללה הרפואית של אוניברסיטת ויסקונסין, מילווקי, WI
FITC גריפוניה לקטיןסיגמא אולדריץ'L9381
TRITC Helix pomatia לקטיןסיגמא אולדריץ'L1261
אגרפישרBP1423-500
0.22 מיקרון ניטרוצלולוזBioRad162-0112
קולגנאז סוג 2וורת'ינגטוןLS004176
סרום בקר עובריHycloneSH30898.03IH
PenStrepGibco15070063
Carbenicillin מלח דיסודיוםSigma C1389
10,000 מגה-וואטניתוק MilliporeUFC801008
אשלגן פוספט די-בסיסיסיגמא 795496-500G
מגנזיום פוספט heptahydrateMP ביו-רפואיMP021914221
חומצת לימוןG Biosciences50-103-5801
נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrateSigmaS9506-500G
רוזנת מונה תאים אוטומטיInvitrogenC10277
רכזי מיקרוצטריפוגה -

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
  2. Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudomonas aeruginosaPulmonary Endothelial CellsCytotoxic AmyloidsLactate Dehydrogenase AssayThioflavin T BindingImageJ AnalysisImmunoblottingA11 Anti amyloid AntibodyOligomeric TauAmyloid Beta

Related Articles