Metoder för att upptäcka cytotoxiska amyloid följande infektion av pulmonell Endothelial celler av Pseudomonas aeruginosa
Summary
Enkla metoder beskrivs för att demonstrera produktion av cytotoxiska amyloid efter infektion av pulmonell endotel av Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Patienter som överlever lunginflammation har förhöjda dödstalen under månaderna efter utskrivning från sjukhus. Det har varit hypotes om att infektion av pulmonell vävnad under pneumoni resulterar i produktion av långlivade cellgifter som kan leda till efterföljande slutet organsvikt. Vi har utvecklat in vitro- analyser för att testa hypotesen att cellgifter är producerade under pulmonell infektion. Isolerade råtta pulmonell endotelceller och bakterien Pseudomonas aeruginosa används som modellsystem, och produktionen av cytoxins efter infektion av endotelceller av bakterier kan påvisas med hjälp av cellodling följt av direkt kvantifiering med laktatdehydrogenas analyser och en roman mikroskopiska metoden ImageJ teknik. Amyloid arten av dessa cellgifter demonstrerades genom Tioflavin T bindande analyser, immunoblotting och immunodepletion med A11 anti amyloid antikroppen. Ytterligare analyser med hjälp av immunoblotting visat att Oligomera tau och Aβ producerades och släpptes av endothelial celler efter infektion av P. aeruginosa. Dessa metoder bör vara lätt att anpassa till analyser av mänskliga kliniska prover.
Introduction
Patienter som överlever lunginflammation har förhöjda dödstalen under månaderna efter sjukhus ansvarsfrihet1,2,3,4,5,6. I de flesta fall inträffar döden av någon typ av slut-organsvikt inklusive njur-, lung-, hjärt-, eller lever händelser, samt stroke5,6. Orsaken till den förhöjda dödligheten i denna patientgrupp har aldrig fastställts.
Lunginflammation är klassificeras som antingen vara samhällsförvärvade eller vårdrelaterade (nosokomial) och agenter som kan orsaka lunginflammation omfattar bakterier, virus, svampar och kemikalier. En av de viktigaste orsakerna till nosokomial pneumoni är bakterien Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa är en gramnegativ organism som använder en typ III-sekretionssystemet för att överföra olika effektor molekyler, kallas exoenzymes, direkt till cytoplasman i målet celler7,8. Under infektion av pulmonell endotelceller rikta exoenzymes olika intracellulära proteiner, inklusive en endothelial form av mikrotubuli-associerade proteinet tau9,10,11,12 , leder till endotel barriär uppdelning resulterar i svår lungödem, minskad lungfunktion och, ofta, döden.
Som nämnts tidigare, har patienter som överlever de första lunginflammation förhöjda dödstalen i de första 12 månaderna efter utskrivning från sjukhus. En potentiell mekanism för att förklara detta fenomen är att någon typ av långlivade toxin genereras under den första infektionen som leder till dålig långsiktiga resultat. Två observationer stödjer denna möjlighet. Första, odlade pulmonell endothelial celler som behandlas initialt med P. aeruginosa misslyckas att föröka för upp till en vecka efter bakterierna dödas av antibiotika13. Andra, långlivat prioner och agenter med prion egenskaper har visats i olika människors och djurs sjukdomar, särskilt sjukdomar associerade med nervsystemet14,15.
Metoder för att undersöka potentiell produktion av långlivade cytotoxiska medel under pulmonell infektion har aldrig beskrivits. Här beskrivs en rad enkla in vitro- analyser som kan användas för att utreda cellgift produktion och verksamhet efter infektion med en vanlig lunginflammation orsakar agent, P. aeruginosa. Dessa analyser bör vara lätt att anpassa till undersöka möjliga cellgift induktion efter infektion med andra ämnen som orsakar lunginflammation och supernatanterna som genereras bör också vara användbar för att undersöka effekterna av cellgifter i hela organ eller djur. Slutligen kommer de analyser som beskrivs här troligen vara anpassningsbar att testa djurs och människors biologiska vätskor för produktionen av cellgifter under lunginflammation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, beskrivs enkel in vitro- metoder som att demonstration av generering av cytotoxiska amyloid under infektion med en lunginflammation som orsakar organism. Dessa metoder inkluderar en cell kultur cytotoxicitet analys, immunoblotting, kvantitering av cell dödande med hjälp av en roman mikroskopiska metoden och ThT bindande. Analyser av de cytotoxiska medel har visat att de amyloid i naturen (figur 2 och figur 4) och uppvisar egen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades i delar av NIH grants HL66299 TS, RB och SL, HL60024 TS och HL136869 till MF.
Materials
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man’s friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
