הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס
Summary
Integrase retroviral רקומביננטי oligomers DNA מחקה מסתיים DNA נגיפי יכול יוצרים קומפלקס פעיל enzymatically המכונה של intasome. Intasomes עשוי לשמש ללימודי הביוכימי, מבניים קינטי. פרוטוקול זה מפרט כיצד להרכיב ולטהר intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס.
Abstract
א הגדרת תכונה, צעד הכרחי של מחזור חיי הרטרווירוס הוא השילוב של הגנום הנגיפי לתוך הגנום המארח. כל רטרווירוסים לקודד אנזים integrase (ב) אשר מזרז קוולנטיות בהצטרפות של נגיפי למארח ה-DNA, הידוע בשם strand העברה. שילוב יכול להיות מעוצבת במבחנה עם IN retroviral רקומביננטי ו- DNA oligomers מחקה את הקצוות של הגנום הנגיפי. על מנת לסכם באופן הדוק יותר התגובה אינטגרציה המתרחשת ויוו, אינטגרציה מתחמי are התכנסו from IN רקומביננטי, oligomers סינתטי על-ידי דיאליזה במאגר מלח בריכוז. מורכבות, השילוב של intasome, שנקרא יכולים להיטהר על-ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. במקרה של אב-טיפוס קצפית וירוס (PFV), intasome של tetramer של oligomers דנ א שני והוא מופרד ברצון monomeric IN, אוליגומר חינם הדנ א. יעילות שילוב PFV intasomes ייתכן לבדיקה תחת מגוון תנאים ניסיוני כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה, מכניקה של retroviral אינטגרציה.
Introduction
שילוב של הגנום הנגיפי לתוך הגנום המארח הוא צעד הכרחי במחזור החיים של רטרווירוסים כל1. Integrase אנזים ויראלי (ב) מזרז בהצטרפות קוולנטיות בסוף כל הגנום DNA נגיפי למחשב המארח הדנ א. במהלך זיהום הסלולר, הוא חלק ממתחם אינטגרציה קדם המעביר אינטגרציה. ב רקומביננטי ומורכבת עם כפול oligomers DNA נטושים מחקה את הקצוות DNA נגיפי ניתן גם לבצע אינטגרציה לתוך ה-DNA היעד במבחנה2. יישום נפוץ השילוב assay במבחנה מנצל של פלסמיד supercoiled כיעד הדנ א. שילוב של שני oligomers DNA נגיפי (vDNA) כדי פלסמיד התוצאה היא מוצר ליניארי, הנקרא מתואמת אינטגרציה (איור 2 א). שילוב assay במבחנה גם תניב מוצרים עם אחד בלבד vDNA covalently לצרף את פלסמיד המטרה וכתוצאה מכך עיגול רגוע. מוצר זה שילוב חצי-אתר שנראה חפץ של assay בתוך חוץ גופית.
ב רקומביננטי, vDNA ניתן לבצע אינטגרציה במבחנה, אבל הם לא ריאגנטים אידיאלי עבור חקר הדינמיקות או מבנה של אינטגרציה מתחמי כאשר ב monomeric יטשטש ויזואליזציה הרלוונטיים. מתחמי אינטגרציה מטוהרים, או “intasomes”, נדרשים ללימודי ניתוח או מבנה דינמי מולקולה בודדת. ב PFV ו- vDNAs עשוי להיות התאספו על-ידי דיאליזה מתוך מאגר ריכוז המלח גבוה יחסית ל-3,ריכוז מלח נמוך4. במהלך דיאליזה, התמיסה טפסים. המשקע הזה יוסר דיאליזה, ריכוזי המלח הוא גדל. ריכוז המלח גבוה יותר solubilizes את intasomes PFV המכיל precipitate. Intasomes כבר אז טהור לפי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות). אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס (PFV) ב הוכח קיימים מונומר בפתרון בריכוזים עד מיקרומטר 2255. Fractionation שניה מפריד ביעילות את intasomes PFV (225.5 kDa), הכוללת של tetramer PFV IN, שני vDNAs, PFV monomeric ב (44.4 kDa), חינם vDNA (24.0 kDa). Intasomes PFV יתכן מוקפאות ולשמר את פעילות האינטגרציה במשך לפחות שישה חודשים של אחסון ב-80 הלעפה תרוטרפמט.
Intasomes PFV רקומביננטי ניתן לשינוי כדי לכלול החלפות חומצת אמינו או לחיתוך מוטציות או vDNAs עם4,fluorophores או ביוטין6תוויות. Intasomes PFV מטוהרים בקלות לבצע אינטגרציה לתוך פלסמיד supercoiled יעד ה-DNA במבחנה. תפזורת מבחני הביוכימי אינטגרציה עם intasomes עשוי לבחון את ההשפעות של מוטציות, מעכבי, או תוספים כימיים אחרים. Biotinylated intasomes יכול לשמש כדי לחקור זיקה עם חומצות גרעין או חלבונים. PFV intasomes פונקציונליים בטמפרטורת הסביבה ומאפשר לבדיקה מיקרוסקופית מולקולה בודדת על-ידי פינצטה מגנטי כדי למדוד את הזמן בין הצטרפות של שני הקצוות vDNA או קרינה פלואורסצנטית גמורה להמחיש את החיפוש intasome על המטרה דנ א6. בנוסף, PFV intasomes היו הראשונים להיות מבנית מאופיין להשפיע באופן משמעותי בתחום של שילוב retroviral3.
Protocol
Representative Results
Discussion
תוספות retroviral טופס של multimeric מורכבים עם ה-DNA גנומי הנגיפי לבצע אינטגרציה ולהמשיך את מחזור החיים ויראלי. המספר של מונומרים לכל intasome ייתכן tetramers, octamers או אולי גבוה יותר סדר multimers11,12,13,14. PFV intasomes הם tetramer של רקומביננטי עם כפול גד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH AI099854 ו- AI126742 למפתח.
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
