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Genetics

CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편

Published: September 14, 2018 doi: 10.3791/57457
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 5, 3, 1,2,6
1Department of Dermatology, Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine, 2Program in Cancer Biology, Stanford University School of Medicine, 3Canary Center for Cancer Early Detection, Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 4Department of Biology, Bridgewater State University, 5System Biosciences, 6Veterans Affairs Healthcare System
* These authors contributed equally

Summary

Chromatin 반복; 유전자 규칙에 있는 중요 한 역 그러나, chromatin 루프의 선택적이 고 가역 수정 허용 하는 아무 기술 발전 되었습니다. 여기 우리가 chromatin 루프 개편에 대 한 강력한 시스템 설명 loci를 대상으로 선택적으로 고 역에서 유전자 발현 조절에 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)을 사용 하 여.

Abstract

최근 연구는 명확 하 게 상호 작용 놀이 또는 유전자 발현에 변경의 결과 대 한 책임 인지 반복 하지만 유전자 발현의 규칙에 있는 중요 한 역할은 여전히 반복 하는 장거리, 3 차원 chromatin을 나타났습니다. 알 수 없는. 최근 까지는, 세포 기능과 유전자 활동의 규칙에 미치는 chromatin 반복 상대적으로 모호한 되었으며 이러한 구조를 조작 하는 기존 방법에 제한 금지 이러한 상호 작용의 심층 탐사. 이 불확실성을 해결 하려면 우리는 선택적이 고 가역 chromatin 루프 다시 조직 하는 방법 설계 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)를 사용 하 여. CLOuD9 시스템의 동력 CLOuD9 구문 대상 로컬 chromatin 구조를 조절 하는 게놈 loci의 성공적인 현지화에 의해 증명 되었습니다. 중요 한 것은, 유도 연락처과 내 인 성 염색 질 구조를 복원 하는 능력 또한 확인 되었습니다. 이 방법으로 유전자 발현의 세포 유전자 발현을 조절 하는 능력을 설정 하 고 밑줄 만드는 안정적인 데 노 보 chromatin 루프 유전자를 현저 하 게 영향을 미치는이 기술의 응용 프로그램에 대 한 위대한 잠재력 암과 개발의 컨텍스트에서 식입니다.

Introduction

Chromatin 핵 게놈의 특정 조직에 접는 관계로 진 식1,2와 밀접 하 게 관련 된 것으로 표시 되었습니다 최근 몇 년 동안에 상당한 관심을 얻고 있다. 유전자 활동의 염색 질 구조 사이 정확한 관계 불분명 한 동안, 가설 되는 동적 3 차원 chromatin 조직 결과로 염색체 연락처 사이 상호 작용 제공을 유전자의 규제 기능3. 실제로, 이러한 효과 인간의 globin 유전자 소재 시, 어디 로커 스 제어 영역 (LCR) 활동을 규제 globin 유전자의 발달 특정 방식으로 만들어 두 지역4사이 chromatin 루프에서 잘 입증 되었습니다. 그러나, 둘 다이 고 다른 지역, 그것 아니다 분명 chromatin 루프 인지는 원인 유전자 발현에 변경의 결과.

지금까지,이 현상을 공부에 도전 미해결에 남아 있었다. 예를 들어 유도 chromatin 루프에서 다른 시도 선형 DNA 순서 또는 반복5,6, 촉진 하는 특정 요소에 대 한 배경 지식 풍부 하 게 요구 하는 복잡 한 절차를 수정 관련 7,8. 또한, 이전 작업은 그 chromatin 루프 드라이브 유전자 발현 특정 하 고 제한 된 컨텍스트7,에 제안 하는 동안8, 수준 있는 chromatin에서 반복 영향 전사 세계적으로 불투명 하다. 장거리 반복 유전자 발현에 미치는 영향에 대 한 관심은 최근 몇 년 동안에 지속적으로 성장 하고있다, 비록 chromatin 연락처 변경 유전자 활동을 유지 하는 설정에 대 한 의문점이 계속 됩니다.

우리가 설계 하는 기술을 광범위 하 게 적용 가능한 모든 게놈 loci9의 대상에 대 한 수 있도록 nuclease 결핍 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)-CRISPR-관련 단백질 (dCas9), 9를 사용 합니다. 이 기술은 선형 DNA 시퀀스의 수정에 관련 된 복잡 한 문제를 제거 하 고 특정 반복 구성의 중요 한 사전 지식 없이 액세스할 수 있습니다. 특히,이 도구는 보편적이 고 광범위 하 게 다양 한 질병, 암 등 뿐만 아니라 개발에서 인식 하는 chromatin 루프에 적용. CLOuD9의 파워는 역 효과적으로 유전자 발현을 조절 하는 루프의 구조를 변경 하 여 보여 줍니다.

Protocol

1입니다. gRNA 디자인

  1. 디자인 가이드 RNAs10표준 gRNA 디자인 도구를 선택 합니다. 이전 개발된 CLOuD9 구조9 의 보완적인 쌍을 사용 하 여 (즉, 1 S. 구 균 (CSA)와 1 S. pyogenes (CSP) 구성) 각 실험에 대 한.
    1. 선택한 온라인 설계 도구를 사용 하 여 Protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 시퀀스 "NGG" 가이드 길이 20의 CSP와 PAM에 대 한 혈압 CSA에 대 한 가이드 길이 21의 "NNGRRT" 시퀀스.
    2. 선택 가이드 특이성에 따라 점수와 디자인 작업 가이드를 얻기의 기회를 최대화 하기 위해 두 가닥에 가이드.
    3. 올리고 제조 업체에서 가이드 당 2 oligonucleotides 주문: 앞으로 올리고, "caccg" 5' 끝에 가이드 시퀀스의 고 역 oligo에 대 한 추가, 주문 하기 전에 "aaac" 5' 끝에 3' 끝에 "c" 추가.
  2. 처음에, 3-5 gRNAs 250-1000 bp 지역에 걸쳐 관심의 각 지역에 대 한 디자인. 다음과 같이 효율을 대상으로 gRNA를 평가:
    1. Active Cas9 플라스 미드로 복제 확인 gRNAs (3 단계 참조) 정도 293T 세포 (4 단계 참조)에 transfect,11.
    2. 2-3 d에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스 (펜 strep)에 대 한 세포 성장 다음 수확 하 고 게놈 DNA12를 추출 합니다.
    3. 연쇄 반응 (PCR)에 의해 대상된 영역을 증폭. 1.5 %agarose 젤에 제품을 실행 하 고 적절 한 밴드를 정화.
    4. T7 endonuclease 분석 결과 Guschin에 설명 된 대로 수행 외. 프로토콜13,14.
      참고: 효율적인 가이드 대상 사이트에 DNA를 자르기 위하여 결정 된 그는.

2. 세포 배양

  1. 세포는 건강 하 고 적극적으로 나눈 상태에서를 유지 관리 합니다.
    1. K562s, 10 %FBS 1% 펜 strep 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 미디어에서 문화에 대 한
      1. K562s 유지 보수에 대 한 25 cm2 canted 목 플라스 크에서 성장 하 고 매일 mL 당 400000 셀에 셀 밀도 조정.
      2. K562s로 불리고 되었습니다가지고 후 CLOuD9 생성, 2 µ g/mL puromycin와 100 µ g/mL hygromycin 유지 보수 미디어를 추가 합니다.
    2. 293Ts에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10 %FBS 1% 펜 strep 문화에 대 한
      1. 293Ts 10 cm2 접시에서 성장 하 고 분할 때 confluent.

3. 플라스 미드 준비 및 gRNA 삽입15

참고: 플라스 미드 맵 부록에서 사용할 수 있으며 예제에서는 실험에 활용 하는 뇌관 보충 표 1에서 사용할 수 있습니다.

  1. 믹스 5 µ g lentiviral CRISPR 플라스 미드의 BsmBI, 알칼리 성 인산 가수분해 효소, 버퍼, x 10의 6 µ L 및 갓된 100 mM DTT의 0.6 µ L의 3 µ L의 3 µ L와. DdH2O 60 µ L을 총 볼륨을 가져오고 소화 하 고 dephosphorylate 플라스 미드를 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  2. 젤 소화 플라스 미드 정화 하 고 elute ddH2o.
  3. T4 결 찰 버퍼, ddH2O, 6.5 µ L와 0.5 µ L 10의 1 µ L로 각각 100 µ M에 대응된 가이드의 믹스 1 µ L T4 PNK, 10 µ L 총 볼륨에 도달. 30 분, 5 분 동안 95 ° C 다음 37 ° C에서 품 어 다음 25 ° C에 5 ° C/min까지 진입로.
    참고:이 가이드의 쌍을 anneal 것입니다.
  4. DdH2오 (단계 3.3)에서 단련된 가이드 1: 200으로 희석
  5. 믹스 1 µ L 단계 3.2에서에서 소화 플라스 미드의 단계 3.4, 버퍼, ddH2O, 1 µ l 고의 리가, 0.5 µ L 5.5 µ L 총 반응 x 2의 2.5 µ L에서에서 희석된 합자 가이드의 0.5 µ L로. BsmBI 소화 플라스 미드에 가이드를 위하여 10 분 실 온에서 이것을 품 어.
  6. Stbl3 박테리아 단계 3.5에서에서 새로 합자 플라스 미드를 변환 하 고 모든 플라스 미드 준비 방법을 사용 하 여 증폭.

4. lentivirus 생산

  1. 6 잘 잘 당 수 750000 293T 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 접시 하 고 10 %FBS 1% 펜 strep DMEM에 그들을 씨앗. 한 우물을 사용 하 여 각 구문에 대 한.
  2. 시드, 후 24 h 10% 신선한 항생제 무료 DMEM 미디어 변경 FBS.
  3. 1 개의 관에서 11 µ L 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 반응11당 OptiMEM 매체의 150 µ L로 희석.
  4. 별도 튜브에 단계 3.6, pMDLg/pRRE, pRSV 회전의 1 µ g의 OptiMEM 매체의 반응11당 150 µ L와 pMD2.G의 0.65 µ g의 0.35 µ g에서에서 CLOuD9 lentiviral 벡터 플라스 미드의 2 µ g을 희석.
  5. 각 반응에 대 한 1:1 비율로 희석된 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 희석된 lentiviral 플라스 미드 혼합물을 추가 하 고 5 분11품 어.
  6. 4.2 단계에서 항생제 무료 293T 세포의 각 우물에 4.5 단계에서 각 혼합된 단지의 전체 볼륨을 추가 합니다.
  7. 48 h 후, 5 분에 대 한 300 x g에서 내려 신선한 튜브와 스핀에 pipetting으로 바이러스 성 생산 미디어를 수집 합니다. 원심, 후 잔류 세포 파편을 제거 하는 신선한 튜브는 상쾌한을 이동 합니다.
  8. 대상 셀의 변환에 대 한 즉시 바이러스 생산 미디어를 사용 하거나 나중에 사용-80 ° C에서 동결.

5. lentivirus 셀의 변환

  1. CLOuD9 응용 프로그램에 대 한 80, 000 셀을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 관심 (보완 CLOuD9 플라스 미드의 구성)의 바이러스 성 각 구문의 250 µ L를 추가 합니다.
  2. 각 미디어의 총 볼륨을가지고 항생제-무료 미디어와 함께 1 ml 원뿔 1-8 µ g/mL (polybrene 활용 셀 형식에 의해 허용의 최대 농도 실험적으로 결정 될 필요 합니다) 사이 최종 농도에 polybrene를 추가 하 고.
  3. 실 온에서 30 분 동안 800 x g에서 셀 스핀 다음 바이러스 상쾌한을 제거 하지 않고 pipetting으로 resuspend. 전체 세포 현 탁 액 셀 문화 접시에 이동.
  4. 24 시간 후 변환, 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에 아래로 회전 셀
  5. 바이러스 성 상쾌한 발음 하 고 일반 세포 배양에 있는 세포를 resuspend.
  6. 다음 날, 셀 문화 매체를 두배로 불리고 셀 선택에 puromycin (1 µ g/l 293T 세포)와 hygromycin (293T 세포에 대 한 25 µ g/mL)을 추가 합니다. 실험적 puromycin 및 hygromycin 실험을 시작 하기 전에 지정 된 셀 형식에 대 한 적절 한 농도 결정 합니다.
  7. 모든 다운스트림 실험 하기 전에 적어도 3 d 선택 미디어에 세포를 유지 하 고 모든 실험의 기간에 대 한 선택 미디어에서 유지.

6. 세포 이합체 화 및 밖으로 세척

  1. 1mm Abscisic 산 (ABA)을 추가 하거나 컨트롤 하는 CLOuD9 dimerize 세포 배양에 대 한 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 해당 볼륨 선택 하 고 셀을 불리고. ABA 영수증의 날짜의 6 개월 이내 사용 하 여, 감기, 유지 하 고 사용을 통해 빛에서 그것을 보호. 필요한 경우에 2 mM ABA를 활용할 수 있습니다.
    1. 매일 신선한 ABA (또는 컨트롤에 대 한 DMSO) 실험의 기간에 대 한 제공을 미디어를 변경 합니다.
      참고: 이합체 화의 길이에 제한이 아직 관찰 되었습니다.
  2. 이합체 화 미디어 ABA 포함 하 고 셀 버퍼링 충분 한 인산 염 분 세척 (PBS)를 두 번, 접시의 표면을 커버의 제거를 통해 리버스. 그 후, 셀 취소 dimerized 상태를 유지 하기 위해 ABA-무료 미디어에 문화.

7. Immunoprecipitation와 공동-immunoprecipitations

참고: 확인 하십시오 모든 버퍼 신선 하 고 즉시 사용 하기 전에.

  1. 이합체 화 실험의 다음 완료 수집 및 셀 아래로 회전 다음 상쾌한 발음.
  2. Crosslink 및 셀 아래로 동결
    1. 신선한 재료를 사용 하 여 실 온에서 PBS에서 1% 포름알데히드의 신선한 소재를 확인 합니다. 모든 2 백만 셀에 대 한 회전 하는 동안 정확 하 게 10 분 동안 실내 온도에 1% 포름알데히드의 1 mL와 함께 resuspend 부드럽게.
      참고: 사용 하 여 10 mL의 최소 볼륨 가교에 대 한 미만 10 백만 셀.
    2. 0.125 M, 회전 하는 동안 실 온에서 5 분 동안 부 화 뒤의 최종 농도에 글리신의 추가와 가교를 끄다.
    3. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 1-2 x를 씻어. 다음 셀 펠 릿 스냅 액체 질소에서 냉동 고-80 ° C에 저장 하거나 즉시 사용할 수 있습니다.
      참고: 열 포름알데히드 crosslinks을 반대로 합니다. 돌진, 스냅 동결 없이 셀-80 ° C에 직접 저장할 수 있습니다.
  3. 항 체/구슬 켤레 준비
    참고: 선택 된 항 체 (즉, 다른 세포의 용 해 버퍼 세포 세포의 용 해에 대 한 테스트 및 IP 수행)에 대 한 최적화 조건 가치가 있을 수 있습니다. 2 개의 일반적인 버퍼, Farnham 세포의 용 해 버퍼 및 수정 RIPA 버퍼, IP 효율과 쥡니다 효율에 큰 영향을 가질 수 있습니다. 모든 버퍼 구성 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다. 또한, 마음에 계속 그 chromatin 쥡니다 완료 하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
    1. 짧게 따라 선택한 항 체에 대 한 vortexing에 의해 구슬 resuspend.
    2. 1.5 mL 튜브에 실험에 대 한 구슬의 적절 한 금액을 전송. 시작 지점으로 구슬의 20 µ L를 사용 하 여 항 체의 모든 1 µ g에 대 한. 항 체를 아직 추가 하지 마십시오.
      참고: 사용 하 여 10 µ g 항 체 구슬의 200 µ L로 총 시작 점으로 lysate의 1 밀리 그램에 대 한 항 체는이 암시 하는 것 보다 더 효율적인 알려져 하지 않는 한. 낮은 풍부한 단백질에 대 한이 비율은 조정 될 필요가 있습니다.
    3. Farnham 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여, IP 희석 버퍼에 3 배를 세척 한다. RIPA 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여, RIPA 세포의 용 해 버퍼에 3 배를 세척 한다.
    4. Resuspend 구슬 단계의 7.3.3 동일한 버퍼의 마지막 볼륨 (IP 희석 또는 RIPA 버퍼)를 > 1 x와 < 초기 볼륨 x 5. 즉 100 µ L 초기 비드 볼륨, 100 및 500 µ L 최종 물의 resuspension 볼륨 사이의 사용 합니다.
    5. 적절 한 농도에서 씻어 구슬에 항 체를 추가 합니다. 좋은 하 또는 플래그 항 체 IP CLOuD9 구문에 대 한 사용 하 여 항 체 1:50 (µ g 단백질: µ g 단백질 lysate)와 8 + h와 4 ° C에서 회전 하면서 하룻밤 사이 품 어. 실 온에서 2-4 h 또는 품 어.
    6. 구슬에서는 상쾌한을 제거 하 고 삭제.
    7. 워시 워시 버퍼와 3 x 비즈.
    8. 항 체 (IP 희석 또는 RIPA 버퍼)와 야간 보육에 대 한 활용 하는 버퍼의 최소 볼륨에서 resuspend. 단백질 lysate 결합 때까지 차가운 유지.
  4. Chromatin sonicate
    1. 먼저 셀 알 약 10 분 동안 얼음에 버퍼를 붓기의 추가 함께 세포를 lyse, 침전을 방지 하기 위해 몇 분 마다 세포 터치.
      참고: 일반적으로, 버퍼 붓기의 500 µ L 25 백만 셀에 추가 되 고 거기에서 조정 하지만 마십시오 하지 사용 미만 500 µ L 버퍼에 대 한 < 25 백만 셀.
    2. Dounce 수동으로 모두 시계 방향 및 시계 반대 방향으로, 각각 x 13.
    3. 다음 1500 x g.에 5 분 동안 4 ° C에 아래로 회전 핵은 상쾌한을 완전히 발음 하 고 나머지 상쾌한, 제거를 반복 다음 셀 펠 릿 mg에 무게.
    4. 핵 세포의 용 해 버퍼를 추가 하는 프로 테아 제 억제제 (Farnham 버퍼 또는 RIPA 버퍼, 특히, 하나를 선택).
    5. Resuspend 수송과 핵을 핵 세포의 용 해 버퍼의 10 배 금액을 추가 (예를 들어 추가 핵 세포의 용 해 버퍼의 1 mL 0.100 g 펠 릿). 짧게 소용돌이 얼음에 10 분 동안 lyse.
      참고: 명심 쥡니다 튜브의 크기. 이상적인 볼륨은 종종 < 1 mL, 그래서 샘플 펠 릿은 아주 큰 경우 분할 될 필요가 있습니다.
      1. 공동-IP, 짧게 하 물자를 solubilize 희석 버퍼의 2-3 볼륨 immunoprecipitation를 허용 하는 수준에 SDS를 끄다 핵 sonicate 다음 7.4.6 단계로 진행 합니다. 매우 민감한 항 체에 대 한 추가 SDS의 농도 줄이기 위해 더 희석 버퍼를 추가 합니다.
        참고: 중지 쥡니다 lysate 지웁니다; 그것은 완전히 투명 한 불투명/반투명 흰색에서 변경 됩니다. 샘플을 가능한 차가운 유지 하 고 할 하지 통해 sonicate.
      2. 칩, 철저 하 게 DNA 150-1000 bp DNA 파편을 얻을 수를 sonicate이 다음 7.4.6 단계로 진행 합니다.
    6. 4 ° c.에서 10 분에 대 한 최대 속도에서 불용 성 물질을 스핀
    7. 신선한 튜브에 수용 성 자료를 전송 합니다.
    8. 공동 IP에 대 한 단백질의 농도 측정 하 고 풀 다운 단계 7.5에서에서 계속 합니다.
    9. 칩에 대 한 제거의 10 µ L 약 수 lysate 고 추가 40 µ L IP 차입 버퍼와 6 µ 5 M L 56ul의 총에 NaCl. 95 ° C에서 15 분 동안 boil의 3m NaOAc pH 5, 5-10 µ L을 추가 하 고 PCR 정화 열에 정리. 260에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 농도 측정 nm 및 샘플에 걸쳐 표준화. 그런 다음 풀 다운 단계 7.5에서에서 진행 합니다.
      참고: 추가 lysate 스냅-80 ° C에서 냉동 고 수는 나중에 사용 하지만 최상의 결과 얻으려면 신선한 lysate에서 얻을 수 있습니다. 만약 얼어, 할 하지 동결/동결 해제 lysate 더 여러 번.
  5. 풀 다운
    1. 신선한 튜브에 단백질 lysate의 적절 한 금액을 전송. Farnham 세포의 용 해 버퍼 사용 하는 경우 2.1 양의 IP 희석 버퍼 (위)에 희석.
    2. 입력된 컨트롤에 대 한 상쾌한의 100 µ L를 따로 설정 하 고 날까지 4 ° C에서 저장 합니다.
    3. 지금 샘플 단계 7.3.8에서에서 구슬/항 체 켤레를 추가 합니다.
    4. 밤새 4 ° C에서 샘플을 회전 하 고 1.5 mL 튜브에 액체 움직임에 대 한 충분 한 볼륨 확인을 하십시오.
  6. 워시와 Elute
    1. 하룻밤 회전 후 구속력 분수는 상쾌한을 저장 합니다. 그런 다음 세척 IP 희석 버퍼에 3-5 x 비즈.
    2. 억제제 없이 실 온에서 IP 차입 버퍼를 준비 합니다.
    3. 새로운 튜브를 15 분 이전 차입에 대 한 67 ° C에 소용돌이에 동요 50 µ L 차입 버퍼와 복합 elute 고 반복 또 다른 50 µ L. 결합 그들 모두 총 100 µ L 차입에 대 한.
      참고:이 차입 절차에서 너무 많은 배경이 있는 경우에, 열 수 있습니다 수 감소 또는 떨고/부 화 하는 동안 제거. 이 일반적으로 대상 단백질의 수확량 감소 하지만 백그라운드를 대폭 줄일지 않습니다.
  7. Crosslinks 67 ° C에서 난방에 의해 역 > 4 h.
    참고:이 공동 IPs에 대 한 엄격 하 게 필요 하지 않습니다 하지만 도움이 될 수 있습니다.
    1. 공동 IP 사이 관심의 대상 전체 이합체 화 되도록 실행 있다 SDS 페이지 젤과 하 태그 또는 플래그 태그에 대 한 항 체를 가진 조사에 모두 1: 1, 000에 표시 된 대로. 다음 8 단계를 계속 합니다.
    2. 칩-정량에 대 한 올바른 지역화 및 각 CRISPR dCas9 구성 요소를 대상으로 되도록 열에 차입 제품 깨끗 하 고 10 µ L. 수행 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 순화 된 DNA의에 elute. 뇌관 제시 데이터에서 보충 표 1에서 사용할 수 있습니다. 다음 8 단계를 계속 합니다.

8. RNA 추출 및 정량 PCR

  1. CLOuD9 유도 유전자 발현 변화 조사를 먼저 분리 하 고 제어 셀 펠 릿 및 dimerized 셀 펠 릿 총 RNA를 정화.
  2. 반전 녹음 방송17 에 의해 순화 된 RNA에서 보완 DNA (cDNA)을 확인 하 고 정량 분석을 수행. 뇌관 보충 표 1에서 사용할 수 있습니다.

9. 염색체 구조 붙 잡음 분석 결과

  1. CLOuD9에 의해 유도 된 게놈 loci의 주파수에서 변화를 관찰, 염색체 구조 붙 잡음 (3 C) 수행8분석 실험.
  2. 실시간 양이 많은 PCR에 의해 3 개의 생물 복제의 각각에 대 한 중복의 두 세트에 3 C 결 찰 제품을 계량. Tubulin 로커 스에서 3 C 신호를 샘플을 정상화. 뇌관 보충 표 1에서 사용할 수 있습니다.

Representative Results

CLOuD9 유도 가역 β-globin 발기인-LCR 반복. CLOuD9 시스템의 적절 한 사용 보완 CSA의 가역 접촉을 유도 하 고 CSP CLOuD9 추가 또는 제거 ABA의 세포 배양 (그림 1a)를 통해 생성. CSA 및 CSP 구조 (그림 1b) 적절 한 게놈 영역 표준 CRISPR gRNAs를 사용 하 여 지역화 됩니다. 인간의 globin 소재 시로 자주 염색체 접는 및 거기 개발 하는 동안 발생 하는 재배치의 광대 한 문서, 고려이 지역 CLOuD9 시스템의 유틸리티를 보여 주기 위해 선택 되었다. 또한, K562 셀 라인 지속적으로 β-globin 유전자는 일반적으로 건강 한 성인 erythroid 계보 세포에 표현 된 반대, 태아 γ-globin 유전자의 높은 레벨을 표현 하 보였다 때문에 선정 되었다. K562 셀을 사용 하 여 유전자 발현을 수정할 CLOuD9 수가 셀 라인에서 β-globin 유전자의 식을 복원 하 여 시험 될 수 있다.

이합체 화, immunoprecipitation-정량 PCR (칩-정량) 정확 하 게 지역화 하 고 각 CLOuD9 구성의 대상으로 이용 되었다 chromatin의 유도 전에 (보충 그림 1). 또한, 공동-immunoprecipitation (공동-IP)와 ABA 없이 체코 및 CSP 이합체 화 (그림 1 c 와 보충 그림 2) 리간드의 부재에서 가역 뿐만 아니라 ligand의 존재 확인. ABA를 추가한 후 24 h β-globin와는 LCR 사이 큰 접촉 등장 두 이합체 화 부분과 세포에서 염색체 구조 캡처 (3 C)로 측정 된 하지만 포함 된 두 개의 체코 또는 CSP 구문, 따라서 유효성 검사 컨트롤 하지는 chromatin 변경 대상된 사이트 (그림 1 c와 보충 인물 3, 4)에 대 한 특이성 LCR-β-globin 상호 작용 만들기 생 LCR globin 접촉을 완전히 제거 하지 않은 있지만 대신, 이전에 보고 된8으로 원래 연락처에 추가. Β-globin/LCR 연락처 증가의 이합체 화 영역 내에 대상 LCR과 β-globin 발기인 (보충 그림 5, 6) 정확한 지역에 최대 72 h에 대 한 관찰 되었다. 마지막으로, 시스템의 가역 생 구조 (그림 1 d 및 보충 그림 3-6)의 완전 한 갱신을 보여준 ABA를 제거한 후 3 C로 확인 됐다.

우리는이 아이디어를 탐구 하는 두 번째 셀 라인 이용 되었다 그래서 K562 셀에 표시 된 성공 euchromatin (그림 1의 d)의 영역에 globin 소재 시 위치의 결과 있을 수 있습니다 간주 됩니다. CLOuD9 시스템 HEK 293T 세포는 heterochromatic 고 globin 유전자 (그림 1e)를 표현 하지 않는 영역에 적용 되었습니다. 결과 무슨 K562s;에서 관찰 되었다 비슷합니다. 더 많은 β-globin LCR 협회 3 c (그림 1e 및 보충 그림 3), ABA와 24 시간 후 측정 되었다 CLOuD9의 강력한 수 원래 chromatin 상태에도 불구 하 고 서로 다른 셀룰러 환경에서 기능에 대 한 증거를 제공 하 또는 나 란입니다.

추가 loci Oct4 발기인 등 말 초 5' 증강 293T 세포 내 CLOuD9의 광범위 한 적용을 보장 하기 위해 테스트 되었습니다. 이전, 아니 감지 Oct4이 셀 라인 표현과 더, 생 연락처 설명 되었습니다. 원심 5' 증강 인자와의 접촉에서 유래 하는 배아 줄기 세포에 Oct4 식의 증거 동기이 실험 하 고 동일한 결과 β-globin 소재 시18에서 관찰 되었다. 연락처는 Oct4 사이 원심 증강 및 발기인은 CLOuD9 활성화 셀만 하지 컨트롤 셀 (그림 1 층)에서 확인 되었다. 또한, Oct4 발기인 및 원심 5' 증강 상호 작용 또한 증강 3' Oct4 발기인 연결할 메시지가 관찰 되었다. 이 이벤트는 3' 증강 Oct4 발기인/5와 상호 작용 하는 증거와 일치 ' 원심 증강 내 생 유전자 활성화10동안 복잡 한.

CLOuD9 유도 컨텍스트 특정 변경 유전자 loci에. CLOuD9 시스템 유전자 loci에서 염색체 연락처를 유발 사실 확인 후 우리 유전자 발현에 루프의 영향을 조사 하고자 했다. 고 globin Oct4 유전자에 대 한 전사는 LCR과 globin 유전자 loci 사이 및 원심 5' 증강 Oct4 발기인, 각각1,11사이 접촉에 파견으로 문서화 되었습니다. 따라서, 우리는 사용 하 여 강력한 유전자 발현 시스템 드라이브 chromatin 루프 형성이 지역의 각각을 인해 CLOuD9 가설.

두 loci 실시간 정량 시연 그 유도 ABA chromatin 루프 운전 증가 K562 세포에서 β-globin 식에서 293T 세포에 Oct4 식에서 비록 293Ts에서에서 (그림 2a). 비록 ABA 조금 24 h 증가 β-globin 식 문화를 크게, 셀에 식 추가 계속 꾸준히 최대 72 시간 증가 하 그리고 ABA 유실 (그림 2a)에 따라 가역 했다. 모든 컨트롤을 제외한 K562 셀 이합체 화 구성 요소 LCR과 β-globin 발기인 영역 (그림 2a 및 보충 그림 7, 8)에 위치 했다 할지라도이 추세를 따 랐 다. 이러한 연구 결과, 지원 칩-정량 H3K4me3 및 K562s 및 293Ts에서 β-globin 소재 시에서 RNA Pol II의 전사 (그림 2 c-f)에서 관찰 된 변경으로 대응 했다.

CLOuD9 안정적인 chromatin 루프 설정. CLOuD9와 단기 루프 유도 명확 하 게 뒤에 기대, 비록 관찰 유지 여부 반복의 장기 유도 했다 차동 효과. 이 조사, 셀 10 일 동안 ABA의 경작 했다. Β-globin 식에서 변경 관찰 했다만 여전히 동안 K562s와 293Ts β-globin 소재 시 및 컨트롤 (그림 3a, b 와 보충 그림 9, 10)을 기준으로 LCR 사이 증가 접촉 주파수 전시, K562 셀 (그림 3c)에서. 그러나 흥미롭게도,, 그것은 관찰 되었다 그 장기 K562s, 전사가 강하게 upregulated, 이합체 화는 더 이상 가역 (그림 3a와 보충 그림 9-11). 그러나, 어디 녹음 방송에 있는 아무 변경 장기 이합체 화 다음 관찰 되었다, 293Ts에서 chromatin 연락처 가역 남아 있었다 (그림 3b 와 보충 그림 9)에서 변경 유도.

전반적으로, 유전자 발현에만 작은 감소는 이합체 화 (그림 3c) 전에 유전자 식 수준 보다 훨씬 높은 남아 ABA 제거의 10 일 후에 관찰 되었다. 이 따라 K562 셀, 하지만 하지 293T 세포, H3K4me3 및 칩-정량 하 여 β-globin 소재 시에서 RNA Pol II에 지속적인된 변경 보였다에 비해 컨트롤, ABA 제거 (그림 3d-f)의 10 일 후에. 따라서, 우리의 결과 chromatin 루프의 안정성 더 많은 지속 가능한 유전자 발현 의미를 나타냅니다.

Figure 1
그림 1: CLOuD9 가역 β-globin 발기인-LCR 반복을 유도 한다. (a) abscisic 산 (ABA, 녹색)의 추가 제공 두 보완 CLOuD9 구문 (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 미 균 (CSA), 레드와 블루, 각각) 근접, 개장 하는 chromatin 구조에. ABA의 제거는 내 인 성 염색 질 구조를 복원합니다. (b) CLOuD9 구문 역 dimerizeable PYL1 및 ABI1 도메인 S. 구 균 과 S. pyogenes 에서 CRISPR dCas9 기술을 결합합니다. (c) 타임 라인의 CLOuD9 이합체 화 실험. (d) 3 C ABA (레드)와 치료의 24 h 후 K562 셀에 측정 β-globin 소재 시 전체 가교 주파수 분석 결과 및 후속 유실 (파란색)의 가역을 보여주는 유도 β-globin/LCR 연락처 (회색으로 강조 표시). 오렌지 화살촉 특정 CLOuD9 구문을 대상 영역을 나타냅니다. EcoRI 조각 LCR (검은 막대)의 과민성 사이트 1-4를 포함 하는 앵커 지역으로 사용 되었다. 다른 표시 EcoRI 조각 (그래프 위에 이름)와 주파수의 가교 평가 됐다. 인간의 β-globin 유전자와 LCR 과민성 사이트 염색체 위치 좌표와 그래프의 맨 아래에 묘사 된다. H3K4me3와 H3K9me3의 칩 seq에서 데이터 보여주는이 지역에서 K562s. (e) 비슷한 euchromatic chromatin 구조의 가역 변화 HEK 293T 세포, H3K4me3 및 H3K9me3 칩 seq 데이터에서 증거에도 불구 하 고 볼 수 있습니다 하는 globin 지구는 heterochromatic이 셀 형식에서. (f) 3 C 분석 결과 293T Oct4 로커 스 전체 가교 주파수 측정 보여주는 ABA (빨간색)와 치료의 72 h Oct4/원심 증강 연락처 (회색으로 강조 표시) 유도 후 세포. 오렌지 화살촉 특정 CLOuD9 구문을 대상 영역을 나타냅니다. MboI 조각 Oct4 발기인 (검은 막대)를 포함 하는 앵커 지역으로 사용 되었다. 다른 표시 MboI 조각 (그래프 위에 이름)와 주파수의 가교 평가 됐다. 인간의 Oct4 지역 염색체 위치 좌표와 그래프의 맨 아래에 묘사 된다. 모든 3 C 결과 적어도 3 개의 독립적인 실험에서 얻은 했다. 3 C 값 tubulin로 정규화 되었다. Β-globin, 앵커 조각 및 포괄 β/HS 조각 조각 사이 상호 작용 주파수 0로 설정 했다. Oct4, 앵커 조각 Oct4 상호 작용 영역 이외의 부정적인 제어 조각 사이 상호 작용 주파수 0로 설정 했다. 오차 막대 표시 사 우 스 다코타 n = 3. 이 그림 모건, 스테파니 L., 그 외 에 그림 1 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: CLOuD9 유도 컨텍스트 특정 유전자 표현과 chromatin 상태 변경. (a) CLOuD9 유도 chromatin β-globin 소재 시에 반복 293Ts. 치료 하는 제어 셀을 기준으로 주어진 의미에만 K562s의 β-globin 표현의 가역 유도에서 발생 합니다. 양측 스튜던트 t-테스트 * P < 0.05, t = 3.418, df = 5; P < 0.0001, t = 10.42 df = 5; n.s. 중요 한 비입니다. 오차 막대 표시 사 우 스 다코타 n = 3. (b) 유도의 Oct4 식 CLOuD9 유도 293Ts 다음에 관찰 되었다 동일한 장소에서 반복. 의미 치료 하는 제어 셀을 기준으로 제공 됩니다. 양측 스튜던트 t-테스트 * P < 0.05, t = 4.562, df = 2. 오차 막대는 사 우 스 다코타 (c) 의 β-globin 유전자 몸 따라 칩-정량 Pcr 뇌관 위치 회로도 나타냅니다. (d, e) 칩-정량 CLOuD9 유도 반복 다음 β-globin 소재 시 293Ts에 K562s만에서 H3K4me3에 가역 변경 보여 줍니다. 양측 스튜던트 t-테스트 * P < 0.05, * * P < 0.001, * * * P < 0.0001. 오차 막대 사 우 스 다코타 (f) K562s의 β-globin 전사에 중재 변경 증가 RNA Pol II 인 β-globin 유전자 몸 전체에 걸쳐 해당 CLOuD9 나타냅니다. 양측 스튜던트 t-테스트 * P < 0.05, * * P < 0.001, * * * P < 0.0001. 오차 막대 표시 사 우 스 다코타 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 그림 2 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: CLOuD9 강력한 유전자 발현 다음 장기 이합체 화를 유지 하는 안정적인 chromatin 루프 설정. (a, b) 3 C 분석 결과 K562s만 하지 293Ts, chromatin CLOuD9 유도 반복 되 돌이킬 수 없는 ABA 치료의 10 일 후 ABA 최대 10 추가 일에 대 한 제거 하는 경우에 보여 줍니다. 모든 3 C 결과 적어도 3 개의 독립적인 실험에서 얻은 했다. 3 C 값 tubulin, 표준화 했다 그리고 앵커 조각 및 포괄 β/HS 조각 조각 사이 상호 작용 주파수는 0으로 설정 했다. 오차 막대 표시 사 우 스 다코타 n = 3. (c) K562s에 있는 루프 안정화의 β-globin, 심지어 ABA 유실의 10 일 다음 영구 식에서 발생 합니다. Β-globin 식 변경 293Ts. 치료 하는 제어 셀을 기준으로 주어진 의미에서 관찰 된다. 양측 스튜던트 t-테스트 * * * P < 0.0001, t = 5.963, df = 5; CLOuD9 유도 루프에 대 한 응답 β-globin 소재 시에 H3K4me3 마크 n.s. 중요 한 비 (d) 칩 정량 보여주는 증가 ligand 희미하게 K562s. 양측 학생의 t에서 10 일 다음 지속 됩니다-테스트 * P < 0.05, * * P < 0.001, * * * P < 0.0001. (e) H3K4me3 없음 중요 한 변경 신호 다음 장기 이합체 화 293Ts. (f) 다음 장기 루프 유도 β-globin 소재 시의 RNA Pol II 증가 인에서에서 칩 정량에 의해 관찰 되었다 K562s에서 유지 되었다 다음 ligand 유실의 10 일. 양측 스튜던트 t-테스트 * P < 0.05, * * P < 0.001, * * * P < 0.0001. 모든 오차 막대 표시 사 우 스 다코타 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 그림 3 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: CLOuD9 구조 그들의 목표 지역에 지역화. Chromatin immunoprecipitation와 정량적 PCR의 CLOuD9 구조 그들의 의도 된 게놈 loci 올바른 지역화를 보여 줍니다. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 1 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 2: CLOuD9 구문 역 ABA 치료에 연결. 공동-immunoprecipitations ABA 치료의 다음 72 h는 dCas9 단백질의 협회를 보여주는 다음 후속 ligand 유실의 72 h 반전. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 2 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 3: 제어 치료 유도 chromatin 연락처 변경. 24 시간 동안 DMSO, 제어 에이전트와 치료 중 K562 셀에 3 c 생 chromatin 구조 변경 유도 또는 값 HEK 293Ts. 3 C tubulin, 및 앵커 조각 조각 사이 상호 작용 주파수로 표준화 했다 β/HS 조각 포괄 0으로 설정 했다. 오차 막대 표시 sd. n = 3. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 3 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 4: 제어 CLOuD9 불리고 셀 표시 없음 변경 chromatin 반복. 2 감독 CLOuD9 생성 하는 LCR 또는 β-globin 발기인 3 c 제어 치료 기준으로 ABA 치료 따르는 chromatin 구조에 중요 한 변경 유도. 3 C 값 tubulin, 표준화 했다 그리고 앵커 조각 및 포괄 β/HS 조각 조각 사이 상호 작용 주파수는 0으로 설정 했다. 오차 막대 표시 sd. n = 3. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 4 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 5: 이합체 화 72 시간 후 가역 남아 CLOuD9 chromatin 반복. K562s 분석 결과 3 C CLOuD9의 가역 ABA 치료의 72 시간 후 β-globin/LCR 연락처를 유도 하는 방법을 보여 줍니다. 3 C 값 tubulin, 표준화 했다 그리고 앵커 조각 및 포괄 β/HS 조각 조각 사이 상호 작용 주파수는 0으로 설정 했다. 오차 막대 표시 sd. n = 3. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 5 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 6: CLOuD9 유도 β-globin/LCR 반복 하지 globin 대상 사이트에 의해 영향을. ABA 치료의 72 시간을 다음 3 c는 LCR 또는 루프 유도 비슷한 가역 변화에서 β-globin 발기인 결과의 다른 지역에 생성 CSA와 CSP를 감독 합니다. 3 C 값 tubulin, 표준화 했다 그리고 앵커 조각 및 포괄 β/HS 조각 조각 사이 상호 작용 주파수는 0으로 설정 했다. 오차 막대 표시 sd. n = 3. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 6 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 7: CLOuD9 유전자 발현 유도 변경 globin 대상 사이트에 지속 됩니다. Β-globin 발기인의 다른 지역에 생성 CSA와 CSP를 감독 하 고 LCR의 이합체 화 72 h에 따라 유전자 발현의 유도 영향을 주지 않습니다. 그러나, 일부는 이합체 화 장기 (10 일) 다음 관찰 되었다 유전자 발현 강도 영향, β-globin 처리 제어 셀을 기준으로 높은 수준의 지속적인된 다음 후속 ligand 희미하게 10 추가 일에 대 한 했다. 의미 치료 하는 제어 셀을 기준으로 제공 됩니다. p < 0.001, t = 10.25, df = 5; p < 0.0001, 왼쪽 오른쪽 t = 8.697, df = 6, t = 40.31, df = 7; n.s. 중요 한 비입니다. 모든 오차 막대 표시 sd. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 7 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 8: 제어 CLOuD9 불리고 셀 β-globin 식에서 아무 변경 보여. 2 감독 CLOuD9 생성 하는 LCR 또는 β-globin 발기인 유도 β-globin 식 제어 치료 기준으로 ABA 치료를 다음에 중요 한 변화가 없다. 의미 치료 하는 제어 셀을 기준으로 제공 됩니다. n.s. 중요 한 비입니다. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 8 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 9: 장기 제어 치료 유도 chromatin 연락처 변경. DMSO, 제어 에이전트와 10 일 동안 치료 중 K562 셀에 3 c 생 chromatin 구조에 변화를 유도 또는 값 HEK 293Ts. 3 C tubulin, 및 앵커 조각 조각 사이 상호 작용 주파수로 표준화 했다 β/HS 조각 포괄 0으로 설정 했다. 오차 막대 표시 sd. n = 3. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 9 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 10: 장기 CLOuD9 유도 β-globin/LCR 반복 하지 globin 대상 사이트에 의해 영향을. LCR의 다른 지역에 생성 CSA 및 CSP 감독 또는 ABA 치료 10 일 후속 ligand 유실의 10 일 다음 3 c와 같이 β-globin 발기인 결과에 마찬가지로 루프 유도 지속. 3 C 값 tubulin, 표준화 했다 그리고 앵커 조각 및 포괄 β/HS 조각 조각 사이 상호 작용 주파수는 0으로 설정 했다. 오차 막대 표시 sd. n = 3. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 10 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 11: CLOuD9 구문 irreversibly 장기 ABA 치료에 연결. 공동-immunoprecipitations 돌이킬 수 없는 협회 ABA 치료의 10 일 및 리간드 유실의 후속 10 일 체코와 CSP dCas9 단백질의 시연. 이 그림은 모건, 스테파니 L., 외에 보조 그림 11 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 표 1: gRNAs, qRT-PCR, 3 C, 및 칩 정량에 대 한 시퀀스 목록 뇌관의. 이 테이블은 모건, 스테파니 L., 외에 보충 표 1 에서 수정 되었습니다. 9. 제발이이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

The most CLOuD9 chromatin 반복에서 중요 한 단계는: 1) 디자인 또는 올바른 gRNAs를 사용 하 여, ABA 또는 DMSO를 포함 하 여 CLOuD9 불리고 셀에 매일 2) 변화 미디어 3), ABA의 신선도 유지 하 고 4)의 정확 하 고 주의 깊은 평가 수행 염색 질 구조입니다.

CLOuD9의 한계는 주로 선택의 대상 지역에 가이드를 설계 하는 능력에 거주. 가이드 RNAs 대상 DNA 영역을 수 dimerized dCas9 구성 요소를 지역화 하는 중요 한 작업을 수행 하 고 그들의 특정 타겟 사이트를 기반으로하는 가이드의 효능. 적절 한 gRNA 구성 요소 없이 시스템 역 형성 수 없습니다 CLOuD9 유도 루프. 따라서, 관심의 각 지역에 대 한 여러 지침을 디자인 하 고 250-1000 bp의 지역을 통해 가이드를 확산, 여 적어도 하나의 성공적인 가이드 보장 될 것입니다. 가이드 위치 정확한 결과에 필수적인 이기도합니다. 배경 효과와 같은 전사의 여기저기를 방지 하기 위해 전사 인자 바인딩 사이트 또는 다른 중요 한 지역에 있는 가이드를 피하기 위해 중요 하다. 또한, CLOuD9 구조물의 정확한 위치 수 약간 대상 유전자의 녹음 방송에 영향을. 이 실험적인 목적을 위한 가장 강력한 쌍을 식별 하는 각 대상 지역에 대 한 가이드의 여러 쌍을 테스트의 중요성을 강조 한다. 또한, 대상 영역의 각 쌍에서 체코 구문 S. 구 균, gRNAs와 대상 해야 하 고 CSP 구성 한다 타겟이 될 gRNAs와 S. pyogenes 에 대 한 구체적 대상에 대 한 키를 누릅니다.

정확한 결과 정확한 이합체 화를 보장 하기 위해, 그것은 또한 세포 환경 CLOuD9 구문 변환 다음의 신선도 유지 하는 것이 중요. 매일 미디어 변화와 신선한 dimerizer (또는 제어)의 추가 하면 상호 보완적인 구조 근접에서 유지 하 고 변경 된 염색 질 구조를 보존. 또한, ABA 신선 하 고 제조업체의 프로토콜 (열 감기, 빛 으로부터 보호 유지, 6 개월 이내)에 따라 적절 하 게 저장 된 보장 본격적인 결과 얻기 위해 필수적 이다.

특히, 보다는 오히려 더 일반적으로 FRB와 FKBP 시스템 활용 CLOuD9 위한 ABA dimerizer ABI와 PYL 이합체 화 단백질 사용 되었다. FRB/FKBP 시스템에는 rapalog의 필요성 때문에 암 세포에 독성 CLOuD9의 적용을 제한 것 이다. 대체 ABI/PYL 시스템이이 한계를 효과적으로 사용 될 더 넓게 utilizable CLOuD9 피할.

샨 다, 우리 CLOuD9, 독특하고 강력한 기술 강제로 수 있는 역 사이 장거리 표적 게놈 loci 연락처를 만들 개발 했습니다. Chromatin 루프 유도을 통해 또한 CLOuD9 적절 한 세포에서 유전자 발현을 수정에 활용 될 수 있습니다 설명 합니다. 기술의 적응성 반복 영역 또는 반복 메커니즘의 사전 지식 없이 어떤 두 게놈 loci 사이 상호 작용의 제한 없는 연구에 대 한 수 있습니다. 또한, CLOuD9의 독특한 시연된 반전 기능 추가 반복 메커니즘의 질병 및 개발 시험이 있습니다. Chromatin 반복의 목표에 효과 명확 하 게 입증 되어 있다, 그러나 있다 아직 데이터 대상에 루프에 오프 대상 반복 하 고 후속 영향의 효과에 대 한 통찰력을 제공.

우리의 데이터는 몇 가지 응용 프로그램에만이 도구를 보여 줍니다 하지만 chromatin 배치는 지표 유전자 발현의 주요 기본 아이디어를 의미. 우리의 기술은 연구 하 고 있는 유전자, 유전자의 녹음 방송에 있는 접는 chromatin의 역할의 전반적인 이해력 향상 chromatin 구조의 뉘앙스를 공개 사용할 수 있습니다. 연구 및 암, 유전 질환, 선 천 성 장애, 어떤 뚜렷한 chromatin에서 어셈블리는 의심할 여 지 없이 진 식20, 변경의 치료 방법을 끌 수 있습니다 transcriptional 역학의 예민의 더 나은 이해 21,,2223. CLOuD9 기술을 활용 하 여 후속 작업 정렬 및 chromatin 도메인 및 개발 및 질병에 안정적인 유전자 발현을 유지 하기 위해 접는 운전 방법의 역학에 대 한 내용을 더 켜 집니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 헤 창, 토니 오로, S. Tavazoie, R. 플 린, P. 바티스타, E. Calo 및 전체 왕 실험실 기술 지원 및 원고의 중요 한 읽기에 대 한 감사합니다. S.L.M.는 NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028), 국립 암 연구소 (1F99CA222541-01)를 통해이 작품에서 지원 되었습니다. K.C.W. 의료 과학자 버로우즈 Wellcome 기금에서에 대 한 경력 수상에 의해 지원 됩니다 그리고 도널드 E. 이며 델리 아 B. 터 재단 교직원 학자.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640  media Life Technologies 11875-119 For K562 cell culture
DMEM media Life Technologies 11995-065 1X, for 293T cell culture
lentiCRISPR v2 Addgene plasmid #52961 For CLOuD9 plasmid development
pRSV-Rev Addgene plasmid #12253 For lentivirus production
pMD2.G Addgene plasmid #12259 For lentivirus production
pMDLg/pRRE Addgene plasmid #12251 For lentivirus production
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668-019 For lentivirus production
anti-HA antibody Cell Signaling 3724 For immunoprecipitation
anti-Flag antibody Sigma F1804 For immunoprecipitation
DNeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69504 For DNA extraction
TRIzol Life Technologies 15596-018 For RNA extraction
RNeasy Kit Qiagen 74106 For RNA extraction
Superscript VILO Life Technologies 11754-050 For cDNA 
SYBR Green I MasterMix Roche 4707516001 For qPCR analysis
Light Cycler 480II Roche For qPCR analysis
anti-H3K4me3 antibody AbCam ab8580 For ChIP-qPCR
anti-RNA Pol-II antibody Active Motif 61083 For ChIP-qPCR
EDTA free protease inhibitor Roche 11873580001 For protein extraction
4-12% Tris Glycine gel Biorad Any size, For western blot
anti-Rabbit HRP antibody Santa Cruz sc-2030 For western blot
anti-mouse HRP antibody Cell Signaling 7076S For western blot
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000AKU For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000APE For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000FCJ For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data GEO GSM1479215 For ChIP-seq analysis
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10001D For immunoprecipitation
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10004D For immunoprecipitation
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015 For RNA purification
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free Thermo Fisher Scientific 28908 For crosslinking
PX458 Plasmid Addgene 48138 Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 For PCR purification
FastDigest BsmBI Thermo Fisher Scientific FD0454 For cloning guide RNAs
FastAP Thermo Fisher Scientific EF0651 For cloning guide RNAs
10X FastDigest Buffer Thermo Fisher Scientific B64 For cloning guide RNAs
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For cloning guide RNAs
10X T4 Ligation Buffer NEB B0202S For cloning guide RNAs
T4 PNK NEB M0201S For cloning guide RNAs
2X Quick Ligase Buffer NEB B2200S For cloning guide RNAs
Quick Ligase NEB M2200S For cloning guide RNAs
Buffers
Farnham lysis buffer 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water
Modified RIPA buffer 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4
IP dilution buffer 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor
Wash buffer 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate
Swelling buffer 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40
Dilution buffer 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl
IP elution buffer 1% SDS, 10% NaHCO3  

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References

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유전학 문제점 139 Chromatin 루프 폴딩 진 식 CRISPR dCas9 chromatin 유전자 규칙 가역 이합체 화 동적 염색체 재배치.
CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편
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Morgan, S. L., Chang, E. Y.,… More

Morgan, S. L., Chang, E. Y., Mariano, N. C., Bermudez, A., Arruda, N. L., Wu, F., Luo, Y., Shankar, G., Huynh, S. K., Huang, C. C., Pitteri, S. J., Wang, K. C. CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure. J. Vis. Exp. (139), e57457, doi:10.3791/57457 (2018).

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