مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب
Summary
تعرض هذه المقالة بروتوكول بسيط واقتصادي لعزله واضحة وتنقية الخلايا الجذعية الوسيطة من نيوزيلندا الأرنب الأبيض السائل الزليلي.
Abstract
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي مصدر الخلية الرئيسية للعلاج يستند إلى الخلية. يمكن استخدامها لهندسة الأنسجة الغضاريف MSCs من تجويف مفصلي السائل الزليلي. MSCs من السائل الزليلي (SF-MSCs) تم النظر في المرشحين الواعدين للتجدد مفصلي، وعلى الفائدة العلاجية المحتملة قد جعلها موضوعا بحثيا هاما في الآونة الأخيرة. MSCs سادس من تجويف الركبة الأرنب النيوزيلندي الأبيض يمكن أن تستخدم كنموذج متعدية أمثل لتقييم الطب التجديدي البشرية. عن طريق المستندة إلى CD90 المغناطيسي تنشيط الخلية فرز التكنولوجيات (ماك)، هذا البروتوكول بنجاح يحصل على أرنب SF-MSCs (ربسف-MSCs) من هذا الطراز أرنب وكذلك يوضح تماما النمط الظاهري ماجستير من هذه الخلايا باغرائهم للتفريق إلى خلايا الاوستيوبلاستس و adipocytes وتشوندروسيتيس. ولذلك، يمكن تطبيق هذا النهج في بحوث علم الأحياء الخلية وهندسة الأنسجة باستخدام معدات بسيطة وإجراءات.
Introduction
وقد اقترح MSCs كمصدر قيم للطب التجديدي، خاصة بالنسبة للآفات الغضروف. على نطاق واسع أن MSCs، بما في ذلك تشوندروسيتيس وخلايا الاوستيوبلاستس، adipocytes، myocytes الهيكل العظمى والخلايا اللحمية الحشوي، توسيع المجالات لزرع الخلايا الجذعية بسبب بهم التوسع ارتفاع معدل ونسب متعددة التمايز المحتملة1. MSCs يمكن أن تكون معزولة من الهيكل العظمى العضلات والزليلي ونخاع العظام والأنسجة الدهنية2،،من34. أن النتائج التي توصل إليها أيضا confirmed وجود MSCs في السائل الزليلي، وقد حددت البحوث السابقة MSCs المستمدة من السائل الزليلي (SF-MSCs) كمرشحين واعدة للتجدد مفصلي5،6.
ومع ذلك، تخضع البحوث والتجارب الإكلينيكية على العينات البشرية للعديد من القضايا الأخلاقية. بدلاً من ذلك، الأرانب كانت وستظل في الأنواع الحيوانية الأكثر استخداماً لإثبات أن زرع MSCs يمكن إصلاح تلف الغضروف. في السنوات الأخيرة، عددا متزايداً من الباحثين درسوا أرنب الخلايا الجذعية الوسيطة (ربمسكس) على حد سواء في المختبر و في فيفو، كهذه الخلايا هي MSCs مماثلة للبشرية في علم وظائف الأعضاء علم الأحياء والأنسجة الخلوية. وبالمثل، ربمسكس قادرة على التمسك بالأسطح البلاستيكية، عرض مورفولوجيا المغزل تنتجها الخلايا الليفية كما هو الحال في MSCs البشرية. وعلاوة على ذلك، أرنب الوسيطة عينات بسيطة وسهلة للحصول على7. بالإضافة إلى ذلك، النقاط الأكثر أهمية هي أن ربمسكس التعبير عن علامات السطحية، مثل CD44، CD90، و CD105، وأن يتم الاحتفاظ بالتفريق بين النسب المتعددة المحتملة، الذي هو الاتفاق مع المعايير المتعلقة بتحديد هوية السكان MSC حددها “المجتمع الدولي” “العلاج الخلوي”8،9. على وجه الخصوص، تشوندروبروجينيتورس السائل الزليلي قادرون على تشوندروجينيسيس غير الضخامي عند فعل TGF-β1، مما يجعلها مصادر خلية مناسبة لتجديد غضروف مفصلي فينوتيبيكالي10،11، 12.
عزل SF-MSCs غير مختلفة إلى حد كبير من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك الحبل السري والأنسجة الدهنية والدم ونخاع العظام. حاليا، هي النهج الأكثر شيوعاً للتنقية وفرز لسادس-MSCs التدفق الخلوي والقائم على حبة الفرز إيمونوماجنيتيك، وعلى الرغم من أن أسلوب التدفق الخلوي يتطلب وجود بيئة محددة وأدوات مكلفة للغاية13.
تعرض هذه المقالة إجراء لجمع عينات سائل الزليلي من نيوزيلندا بسيطة وكسبها أرانب بيضاء. أثناء الإجراء، ربسف-MSCs ستابلي الموسعة في المختبر وعزلها ثم مع CD90 إيجابية المغناطيسي الإجراءات المستندة إلى حبة. وأخيراً، البروتوكول يوضح كيفية الحصول على MSCs بدرجة نقاء عالية والجدوى من المصادر خلية المقطوع.
وتتميز المعزولة ربسف-MSCs في هذا البروتوكول، استناداً على مورفولوجيا، والتعبير عن علامات محددة، وبلوريبوتينسي للخلايا الجذعية. إيمونوفينوتيبينج على أساس قياس التدفق يكشف تعبير إيجابي كبير CD44 و CD105، بينما التعبير عن CD45 و CD34 السلبية. وأخيراً، يوضح تحليل في المختبر ربسف-MSCs التفريق بين أوستيوجينيك وأديبوجينيك وتشوندروجينيك من هذه الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر وجود MSCs في السائل الزليلي بديل للعلاج يستند إلى الخلية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إصابة مواقع تحتوي على كميات أعلى من الخلايا الجذعية الوسيطة في بهم السائل الزليلي، الذي قد يكون ارتباطاً إيجابيا مع فترة ما بعد إصابة5. قد يكون من المفيد للأنسجة لتعزيز شفاء عفوية بعد إص…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة كانت تدعمها ماليا المنح التالية: “مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية” (رقم 81572198؛ رقم 81772394)؛ الصندوق لبناء ارتفاع مستوى الانضباط الطبية من جامعة شنتشن (رقم 2016031638)؛ مؤسسة البحوث الطبية في مقاطعة قوانغدونغ، الصين (رقم A2016314)؛ شنتشن العلوم والتكنولوجيا المشاريع (رقم JCYJ20170306092215436؛ لا. JCYJ20170412150609690؛ لا. JCYJ20170413161800287؛ لا. SGLH20161209105517753؛ لا. JCYJ20160301111338144).
Materials
| Reagents | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
| Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
| Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
| 75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
| MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
| CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
| TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
| Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
| CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
| CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
| Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
| SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
| cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
| Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
| MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
| Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
| Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
| Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
| Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
| Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |
References
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
- De, B. C., Dell’Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
- Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
- Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
- Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
- Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390 (2014).
- Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
- Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281 (2015).
- Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
- Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
- John, T., Lerche, P. . Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , (2011).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
- Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
- Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
- Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
- Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
- Gronthos, S., Zannettino, A. C. W., Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. , 45-57 (2008).
- Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616 (2012).
- Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308 (2008).
- Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
- Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).
