प्रोटीन पाचन, Ultrafiltration, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी मानव रक्त प्लाज्मा और सीरम से Exosomes के अलगाव का अनुकूलन करने के लिए
Summary
यहां, हम दोनों प्लाज्मा और सीरम कम सह के साथ exosomes शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद गैर exosomal रक्त प्रोटीन की शुद्धि । अनुकूलित प्रोटोकॉल ultrafiltration, चिढ़ा उपचार, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी भी शामिल है । exosomes लाभों का बढ़ाया शुद्धिकरण बुलबुले और proteomic लक्षण वर्णन के अधिक सटीक ठहराव सहित अनुप्रवाह विश्लेषण, ।
Abstract
Exosomes, सभी प्रकार के सेल से जारी nanovesicle का एक प्रकार, किसी भी शारीरिक तरल पदार्थ से अलग किया जा सकता है । exosomes की सामग्री, प्रोटीन और RNAs सहित, कोशिकाओं है जिसमें से वे प्राप्त कर रहे है और रोग के संकेतकों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए अद्वितीय हैं । कई आम संवर्धन प्रोटोकॉल, ultracentrifugation सहित, घुलनशील प्रोटीन संदूषण के साथ लादेन exosomes उपज । विशेष रूप से, हमने पाया है कि रक्त के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन अक्सर सह exosomes के साथ शुद्ध और बहाव proteomic अध्ययन पाया, कम बहुतायत के अगोचर उंमीदवारों की पहचान को विफल कर सकते हैं । अतिरिक्त चिंता का irreproducibility exosome प्रोटीन ठहराव के गैर-exosomal प्रोटीन के स्तर के असंगत प्रतिनिधित्व के कारण है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल को हटाने के लिए गैर exosomal प्रोटीन है कि सह exosomes के साथ शुद्ध, exosome शोधन प्रक्रिया के लिए कठोरता जोड़ने विकसित किया गया था । पांच तरीकों से पांच दाताओं से जोड़ा रक्त प्लाज्मा और सीरम का उपयोग कर की तुलना में थे । विश्लेषण nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और सूक्ष्म bicinchoninic एसिड प्रोटीन परख का उपयोग कर पता चला कि एक संयुक्त ultrafiltration और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी उपयोग प्रोटोकॉल इष्टतम पुटिका संवर्धन और घुलनशील प्रोटीन हटाने झुकेंगे । पश्चिमी सोख्ता सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि एल्ब्युमिन और apolipoproteins सहित अपेक्षित प्रचुर मात्रा में रक्त प्रोटीन, समाप्त कर रहे थे ।
Introduction
Exosomes है nanovesicles (आकार में 30 एनएम से १५० एनएम के लिए) में लगभग सभी कोशिकाओं द्वारा जारी मानव शरीर में सेल की सुविधा के लिए सेल संचार प्रक्रियाओं1,2। दिलचस्प है, exosomes परिवर्तन की संरचना के रूप में अच्छी तरह के रूप में व्यक्तिगत3,4,5के स्वास्थ्य की स्थिति के रूप में मूल की कोशिकाओं पर निर्भर करता है । इसके अतिरिक्त, exosomes जैसे कई जैविक तरल पदार्थ से प्राप्त किया जा सकता है: लार, मूत्र, और रक्त2। इन सुविधाओं के कारण exosomes को रोग प्रतिरोधकों का अच्छा स्रोत माना जाता है । दुर्भाग्य से, वहां exosomes के अलगाव के लिए कोई मानक विधि है । कुछ प्रयोगशालाओं multistep केंद्रापसारक पर विचार, एक अंतिम उच्च गति १००,००० x g पर कदम exosome अलगाव के लिए सोने के मानक विधि के रूप में घनत्व ढाल का उपयोग कर के साथ । हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ultracentrifugation घुलनशील प्रोटीन और अंय exosomes के साथ exosomes के एकत्रीकरण लाती है, exosome अखंडता को प्रभावित करने के अलावा, जो दोनों के बहाव अनुप्रयोगों में बाधा हो सकती है6,7 . exosome अलगाव के अन्य आम तरीकों में शामिल हैं, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं: वाणिज्यिक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) आधारित रिएजेंट, केंद्रापसारक ultrafiltration, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा वर्षा । सुरक्षात्मक ग्लाइकोल (खूंटी) पॉलिमर का उपयोग कर उन्हें हाला और एक गोली के रूप में पैदा करके exosomes को समृद्ध । सीमाएं इस बहुलक का उपयोग अवशिष्ट खूंटी बहुलक और अंतिम उत्पाद में घुलनशील गैर exosomal प्रोटीन की एक बहुतायत के साथ संदूषण हैं । Ultrafiltration एक फाइबर झिल्ली का उपयोग कर बुलबुले को शुद्ध और ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयोग करता है; exosomes फिल्टर के ऊपर बने हुए हैं, जबकि छोटे अशुद्धियों और अन्य प्रोटीन झिल्ली7,8के माध्यम से गुजरती हैं । बस अन्य तरीकों की तरह, केंद्रापसारक ultrafiltration प्रोटीन परिसरों और समुच्चय सहित गैर exosomal प्रोटीन के उच्च स्तर की अवधारण के कारण exosomes को शुद्ध करने के लिए एक सीमित क्षमता है । अंत में, एसईसी शुद्धि के आकार से अणुओं को अलग करने के लिए असुरक्षित राल का उपयोग करता है । एसईसी आशाजनक परिणाम दिखाया गया है, contaminant प्रोटीन और exosomal अखंडता के संरक्षण के बहुमत पर कब्जा करके अंय तरीकों के साथ अनुभवी समस्याओं के सबसे काबू पाने, अलगाव के बाद से गुरुत्वाकर्षण या कम दबाव प्रणालियों पर आधारित है7, 9. हालांकि, एसईसी के दौरान बड़ा प्रोटीन समुच्चय और लिपो10 के सह अलगाव अंतिम exosome तैयारी की पवित्रता को प्रभावित करता है । जबकि कुछ तरीकों सेल संस्कृति supernatants और प्लाज्मा7, या केवल प्लाज्मा9,11से exosome शोधन के लिए परीक्षण किया गया है, वहां तरीकों के प्रदर्शन के बारे में कोई जानकारी नहीं है सीधे रक्त की तुलना एक ही व्यक्ति से प्लाज्मा और सीरम ।
यहाँ, हम पुटिका संवर्धन तकनीक प्लाज्मा और सीरम के बीच अनुवाद कर रहे हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए कार्यप्रवाह की एक किस्म की तुलना करके रक्त exosomes की शुद्धि पर ध्यान केंद्रित. Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और पश्चिमी दाग exosome एकाग्रता, पवित्रता, और अंत उत्पादों में प्रोटीन संरचना में मतभेदों को यों तो इस्तेमाल किया गया । अंतिम विधि, इस प्रोटोकॉल में विस्तृत, पुटिका संख्या बढ़ जाती है और गैर exosomal प्रोटीन के स्तर को कम कर देता है । महत्वपूर्ण रूप से, एल्ब्युमिन और apolipoproteins सहित आम सह-हाला प्रोटीन की एक भारी कमी का प्रदर्शन किया है । रक्त में इन दो प्रोटीन और आवृत्ति जिस पर वे सह exosomes के साथ शुद्ध “शुद्ध” नमूनों के बीच विसंगतियों का कारण बनता है, बहाव का विश्लेषण विषम के उच्च बहुतायत । इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसईसी राल का उपयोग भी शामिल है; राल छिद्रित मोतियों से बना है जिसमें प्रोटीन से छोटे ७०० केडीए मोतियों में प्रवेश कर सकता है. एक बार अंदर, प्रोटीन एक octylamine ligand द्वारा बनाए रखे हैं । eluate exosomes और ७०० केडीए12से बड़ा अणुओं से बना है. इसके अतिरिक्त, आदेश में प्रोटीन समुच्चय और apolipoproteins जो मनका फंसाने से बचने को कम करने के लिए, हम कार्यप्रवाह में एक तंग पाचन कदम शामिल हैं । वर्तमान में, वहां कोई भी exosome उपज को अधिकतम करने में सक्षम तकनीक है, जबकि सह शुद्ध गैर exosomal प्रोटीन । इस अध्ययन से पता चलता है कि एक शुद्धि प्रोटोकॉल है कि एकाधिक वसूली और शोधन विधियों के साथ एक तंग पाचन उपचार को जोड़ती है exosome उपज और रक्त सीरम और प्लाज्मा से शुद्धता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक अनुकूलित विधि को शुद्धता और रक्त से exosomes की उपज बढ़ाने के लिए कई रोगों के लिए एक स्रोत के रूप में सही extracellular बुलबुले की क्षमता में वृद्धि होगी । मानक वर्तमान में exosomes को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया तरीको?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को CSU (to KMD), ATCC कॉन्ट्रैक्ट #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C का एक उपठेका), और बिल एण्ड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (OPP1039688) (KMD/NKG) से आंतरिक निधियों द्वारा समर्थित किया गया । हम अतिरिक्त सहायता के लिए कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय में स्नातक (रीउ) ग्रीष्मकालीन कार्यक्रम के लिए NSF अनुसंधान अनुभव का शुक्र है ।
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
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